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家族性热性惊厥的染色单体型相对风险和传递不平衡分析 |
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关标志的性状，经连锁分析却无法得到连锁的结论。由于我们调查的FC家系均较小，不适合进行一般的Lods法连锁分析，因此我们对现有的FC家系开展了上述5个基因座位的单体型相对风险(genotype-based haplotype relative risk,GHRR)与传递不平衡(transmission disequilibrium test,TDT)分析，以确认可能存在的连锁关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 DNA标本 50个单纯型热性惊厥家系来自北京医科大学第一医院儿科、北京市儿童医院和北京军区总医院，热性惊厥诊断标准为最新国际癫痫综合征分类诊断标准［3］。
1.1.2 cDNA探针和引物 热休克蛋白70 cDNA探针pH2.3由美国西北大学Barbara Wu惠赠；扩增HSP70-1 5′非翻译区和HSP70-2 3′非翻译区的引物由赛百盛公司(Cybersin Inc)合成，D8S84(Mfd8)和D8S85(Mfd18)引物由英国人类基因作图资源中心(HGMP Resource Center)惠赠，序列见文献［1，2］。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 用Miller's Protease-NaCl盐析法［4］。
1.2.2 HSP70编码区Pst Ⅰ位点的Southern杂交 除ssDNA以人胎盘DNA取代以外均按常规［5］。
1.2.3 PCR及电泳 20μl PCR反应体积含50ng DNA,70pmol引物，250μmol/L dNTP，50mmol/L KCl,10mol/L TrisHCl pH8.8,15mmol/L MgCl2，0.1% TritonX-100，1U Dynazyme DNA聚合酶(Finnzymes公司)。于PE2400 thermal cycler上94℃变性5分钟；再94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 1分钟，共30个循环；最后72℃ 10分钟。分别以6%测序胶、8%测序胶、8%聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺＝39∶1)和10%聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺＝29∶1)电泳分离D8S84、D8S85、HSP70-1和HPS70-2的PCR产物，常规银染显色。
1.3 统计学处理 采用基因型相对风险(GHRR)和传递不平衡分析(TDT)［6］。其中GHRR是以四格表计算χ2值：
GHRR：(WZ-XY)2 2n(W+Y)(X+Z)n2 (Haldane公式)
而TDT是假设有关联的等位基因(A1)和非关联等位基因(A2)组成的父(母)应该更可能向受累子女传递A1，如果拒绝该假设，可认为两位点连锁(存在连锁不平衡)。仅父(母)的标志位点为杂合子型的资料才可用于TDT检验。
TDT：(b-c)2/(b+c),df=1 (McNemar公式)
2 结果
2.1 各位点的实验结果和基因型频率见文献［1，2］。
2.2 并非全部家系的基因分型均适合GHRR和TDT分析，符合上述检验要求的资料见表1。
2.3 GHRR分析 5个位点中仅在D8S85位点，等位基因3(A3)FC可能具有关联，见表2。
2.4 TDT分析 采用扩展TDT方法［7］检验各位点，未得到有显著意义的结果。但对各位点的各个等位基因分别分析，对患病杂合子父(母)传递的和未传递的等位基因的TDT检验结果却发现在D8S84位点，16个含等位基因4(A4)的患病杂合子父母中的12个向
表1 5个位点的分型资料
Tab 1 Genotyping data on 5 loci
Markers
标志名称 Family No.fit GHRR
(适合GHRR的家系数) Family No.fit TDT
(适合TDT的家系数)
HSP70 PstI 41 32
HSP70-1 42 40
HSP70-2 43 32
D8S84 49 48
D8S85 45 38
表2 D8S85的GHRR分析
Tab 2 GHRR analysis of D8S85
Affected parents
(患FC父母) A3 allele
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