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血小板生成素转导鼠T淋巴细胞的增殖和分化 |
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希望。我们利用质粒载体将人TPO cDNA经肌肉导入小鼠体内后，观察到了如血小板计数升高［1］、骨髓巨核细胞集落形成单位增加［2］、对化疗毒副作用的抵抗力增强［3］等与多肽TPO分子相同的生物活性。但是在此过程中，血小板计数、骨髓巨核细胞集落形成单位和TPO表达水平的变化并不一致。故我们认为TPO在体内过量表达激活了对它的负调控反应机制，而免疫因子可能是其中的部分因素。经研究，TPO基因治疗鼠血液中IFN-γ、IL-2和TNF-α以不同的方式升高（待发表资料），提示TPO刺激了T细胞的活动。本文利用流式细胞分析术对该过程中T细胞的活动规律进行了研究。
1 材料与方法
1.1 质粒与体内转导 人TPO cDNA来源于胎肝，它的获得及真核表达质粒pcDNA3．hTPO的构建均由我们中心完成。它在小鼠体内能有效地表达人TPO，并体现出相应的生物学活性［2］。同我们以前的方法相一致，本研究把60μg携带目的基因的质粒DNA用lipofection（Gibco BRL）包裹后直接注射到小鼠后肢骨骼肌中。每一时间组包含5只随机动物。以空载体和生理盐水分别做为对照。
1.2 单核细胞的制备 在TPO cDNA导入后的不同时间，从眼底动脉放血，做抗凝处理。处死小鼠，立即用PBS（0．01mol／L，pH7．2～7．4）从股骨腔中冲洗出骨髓细胞；把脾脏和胸腺分别置于上述PBS液中，剪切、研磨，制成组织悬液。所有4种细胞分别加载于Ficoll液上，经800～1 200r／min离心30min，分离单核细胞。
1.3 双荧光抗体标记及流式细胞分析 上述单核细胞各1×106～2×106 PBS混悬液，在4°C避光环境中与FITC交联的抗小鼠CD4（L3T4）和PE交联的抗小鼠CD8抗体（Ly-2，Pharmingen），反应1h。经PBS漂洗后，把样品固定在70％乙醇溶液。保存于4°C避光环境中，直至分析。把样品用PBS漂洗，重悬，在FacStar（Becton Dickinson）上进行分析。一组小鼠的同一种组织源性单核细胞混合后作为一个样品处理。每样品采集、分析5 000个细胞。
2 结果
表1是各组织在不同时期CD4＋、CD8＋细胞及其未成熟前体细胞（CD4CD8＋）的比例；与不加任何处理的小鼠细胞相比，空载体组的各类T细胞亚型并无显著的规律性改变，故相关数据未列出。图1是各组织中淋巴细胞的双参数散点图。
从中可以看到如下的特点：①骨髓T细胞在TPO刺激后出现一个先减少后增多的变化；②胸腺以成熟前期细胞增多为主；③脾脏和血液中的T细胞以成熟细胞的增多为主，其中CD4＋细胞的增加性变化尤为明显，而且血液中的这种改变更要早些。
表1 各T淋巴细胞亚群的频数（％）
Tab 1Frequencies of T lymphocyte subsets（％）
Time
（day） Bone marrow Thymus Spleen Blood
Control trial Control trial Control trial Control trial
3 CD4 6.54 4.04 21.3 24.08 42.66 45.0 56.06 58.18
CD8 9.1 4.64 13.24 9.52 7.2 13.02 16.18 14.64
CD4CD8 4.6 2.58 26.49 26.82 8.12 5.06 8.42 5.02
7 CD4 2.02 1.8 19.74 19.5 28.08 31.44 40.56 37.96
CD8 3.06 4.76 18.96 17.64 13.24 14.68 16.38 16.42
CD4CD8 1.36 1.22 45.58 46.4 9.88 10.6 7.68 7.72
14 CD4 1.00 2.76 25.34 22.78 30.62 32.0 44.16 61.92
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