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左旋多巴诱导PC12细胞凋亡及谷胱甘肽对细胞的保护作用 |
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治疗PD疗效减退的机制即其毒性机理不很清楚，早期大量实验已证实L-dopa对体外培养的多巴胺神经元有毒性作用［1］；后来在体动物实验发现L-dopa对预先给予6-OHDA处理的大鼠黑质多巴胺神经元有毒性作用［2］；近期发现对于预先用线粒体复合物Ⅰ抑制剂鱼藤酮处理后的中脑神经元，低剂量L-dopa 就可以造成多巴胺神经元死亡，而对其它神经元的损害作用不明显，这种损害可以被抗氧化剂所阻断［3］。虽然目前仍缺乏L-dopa在体内对黑质多巴胺神经元有毒性作用的证据［4］，但已明确氧化应激参与了PD病人多巴胺神经元变性，包括黑质神经元脂质过氧化、DNA的氧化损伤（8-羟鸟嘌呤增多）和蛋白质羰基氧化［5］。我们通过观察L-dopa对大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma，PC12)细胞的凋亡诱导作用及抗氧化剂谷胱甘肽对这一过程的影响，为进一步探讨L-dopa治疗PD疗效减退的机制提供新的思路。PC12细胞具有神经分泌细胞和神经元的性质，已广泛用于神经毒理、神经生化等方面的研究，而且PC12细胞在含有的酶类、膜受体及合成的递质等方面很接近于中脑多巴胺神经元［6］，因此我们选PC12细胞作为多巴胺神经元的细胞模型。
材 料 和 方 法
一、实验仪器及试剂
EPICS ELITE 型流式细胞仪（美国Coulter公司），JEM-1200型电镜（日本JEOL公司）。谷胱甘肽（glutathione, GSH）、左旋多巴、核糖核酸酶（ribonuclease, RNase）、蛋白酶K(Sigma公司)，DMEM、马血清(GIBCO公司)，其余试剂为国产分析纯。
二、细胞培养及药物处理
PC12细胞（中科院上海细胞所）置于DMEM培养液中，内含10％马血清，5％胎牛血清。于对数生长期加入L-dopa处理，使其终浓度分别为50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L，对照组加入DMEM液，另设150 μmol/L L-dopa加1.0 mmol/L GSH组。每个浓度组及对照组各8瓶，24 h后收集细胞。
三、透射电镜观察L-dopa处理的PC12细胞
细胞培养及药物处理同前，用琼脂糖预包埋法制样，常规固定，制作超薄切片，透射电镜观察、摄片。
四、DNA琼脂糖凝胶电泳
细胞培养和药物处理方法同前，24 h后收集细胞按常规方法提取DNA，走1.8％琼脂糖电泳。电泳后凝胶用计算机图像分析系统（computer documentation analysis system, CDAS）和GelBase/GeIBIot软件（UVP ImageStore 7 500, 英国）做定量分析，所得结果为DNA被RNase分解成180～200 bp的整数倍的寡聚核苷酸片段占所有DNA的百分率。
五、流式细胞术检测凋亡率
细胞培养及药物处理同前，24 h后收集细胞，PBS洗2遍，70％冷乙醇固定，PBS重悬制备单细胞悬液，加入RNase至终浓度50 μg/mL, PI(100 μg/mL)染色30 min, 流式细胞仪采集数据。
六、统计方法
所有实验数据以均数±标准差（±s）表示，两组间比较用两组均数的t检验。
结 果
一、透射电镜观察细胞形态学改变
单用L-dopa处理组细胞有的胞浆中溶酶体增多，线粒体增生，此时胞核固缩不明显，为早期凋亡细胞，见图1；有的胞核固缩成均质状，胞浆浓缩，胞质中出现大量空泡，溶酶体消失，剩下很多颗粒状残余物，为晚期凋亡细胞，见图2。
Fig 1 The earlier apoptosis cell, lysosomes and mitochondria increased ,chromatin condense slightly (×8 000)
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