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过氧化氢诱导心肌细胞凋亡性和非凋亡性死亡的研究 |
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nly caused cardiomyocyted early biochemical changes, such as increase of free radicals level and membrane permeability ,which were pro-apoptotic injurious features. High concentration of H２O２ (＞10 mmol/L) rapidly induced a necrotic form of death characterized by smeared patterns of DNA digestion on agarose gel electrophoresis and lethal membrane disruption (as measured by LDH release). Exposure of 5～10 mmol/L H２O２ induced cardiomyocytes apoptosis concurrently with biochemical changes of LDH and MDA increase in the medium.
［MeSH］ Oxygen; Hydrogen peroxide; Myocardium; Cells, cultured; Cell death
细胞凋亡是真核生物细胞最基本的生命过程之一，通过激活细胞内源性的自杀机制及时清除生理上不需要的、严重受损的和有潜在危险的细胞。细胞凋亡是一个主动的、由基因指导的细胞死亡过程，它与坏死性细胞死亡可从形态学和生物化学上区分开来。最近的研究表明，心脏疾病时如：缺血/再灌注损伤［1］、心肌梗塞［2］、心力衰竭［3］等人或动物的心脏中，都存在心肌细胞凋亡性死亡，细胞凋亡是心肌细胞死亡的一个重要机制，在心脏重塑、心脏功能障碍进一步发展过程中起重要的作用。但是，人们对心肌细胞凋亡的分子机制仍不清楚。
导致细胞凋亡的许多类型的刺激能造成细胞内活性氧的产生，另外将外源性氧化剂作用于细胞也可诱导细胞凋亡［4］，因此活性氧的产生可能直接参与细胞凋亡过程。过氧化氢(H２O２）是体内氧化代谢的中间产物，同时又是一种活性氧。H２O２的浓度积累达到一定程度会对心肌细胞产生损伤作用。本研究目的是确定H２O２的浓度积累所造成心肌细胞的生物化学改变和细胞形态学所见，以及心肌细胞凋亡产生中，其生物化学改变和细胞凋亡、细胞坏死等细胞形态学所见之间的关系。
材 料 和 方 法
一、心肌细胞的培养［5］
取新生1～2 d的Wistar大鼠的心室肌组织，研碎，用0.25%的胰蛋白酶分别消化5、15、20 min，将后两次的细胞悬液混合在一起。预培养90 min去掉非心肌细胞，以3×10５细胞/mL的密度置入培养器皿中，在36.5℃的CO２(5%)孵箱内进行培养。培养基为MEM(含15%小牛血清)。在培养4 d后细胞达融合状态后施加H２O２损伤因素，作用一定时间后做检测，以不含H２O２的培养心肌细胞作对照。
二、DNA琼脂糖电泳
培养完毕后，将细胞溶解在裂解液中，37℃保温18 h。用酚、氯仿、异戊醇抽提DNA两次，用乙醇-20℃沉淀DNA，过夜。10 000×g离心30 min，沉淀重新溶解在TE中，用100 μg/mL RNase 10 μL于37℃保温1 h。再用酚、氯仿、异戊醇抽提DNA，用70%乙醇沉淀DNA。沉淀重新溶解在TE液中，在1.8%琼脂糖凝胶上电泳，用溴化乙锭染色，紫外灯下观察。
三、流式细胞术(flow cytometry)检测心肌细胞凋亡小体
培养的心肌细胞(2×10６ cells/mL)用胰蛋白酶消化下来后，用PBS洗涤两次，离心去除细胞碎片。以350目尼龙网过滤去除细胞团块，加入RNase至100 μg/mL，37℃消化30 min，50 μg/mL碘化丙锭(PI)4℃染色1 h，ELITE型流式细胞仪检测，以Multicycle软件分析数据，记录亚二倍体峰(aneuploid peak, AP)，即凋亡小体百分率。
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