-2周内死亡。以后由于认识到了肝细胞与肝细胞之间、肝细胞与基质间的相互作用对于肝细胞保持分化功能与活性非常重要，使培养了的肝细胞经长时间的也能保持其功能[2，10]。这是肝细胞培养技术的一个重要突破，因而使动物试验与临床有初步的效果。新改进的技术在培养基质中加有生长因子、激素和细胞外的基质成分以及与肝非实质细胞共同培养。培养技术由最初的单层培养发展到不同的方法如多层平板型、胶原三明治状、球型聚集肝细胞、微囊肝细胞、微载体肝细胞培养、聚乙酰内酯培养等[2，11]。分离后的肝细胞需要固定在载体基质上如微载体、或多孔材料如树脂、或多孔微载体、微型海棉等，其它固定化技术包括将肝细胞置于水凝胶中。目前多用的是将细胞固定后粘附到中空细纤维壁外或腔内培养[6]。
3.2 生物反应器
3.2.1 生物反应器的设计要求：
一个理想的生物反应器应包括以下基本内容：（1）细胞培养技术：生物反应器不仅能满足细胞量的需求，并且应提供足够的膜面积以供肝细胞固定和培养。（2）膜的特性：应保护植入的肝细胞不被宿主排斥，阻止病人血中的抗体和免疫成分进入。现已证实膜截留物质的分子量在5-10万间能有效地阻止免疫成份。期待一种多孔的，海棉状的和相当亲水性的膜，以使细胞更易粘附和发挥更大的功能。（3）生物物应器的生物相容性：如同血液透析器一样，膜的选择和内装的物质不应引起病人的生化和免疫反应。（4）膜的弥散：生物反应器应保证成功地去除血中的毒素并使肝的特殊因子返回到病人的血中[12]。
3.2.2 生物反应器的类型
目前应用最多的生物反应器仍为中空纤维，所用半透膜多是醋酸盐纤维素膜和纤维蛋白修饰的多聚砜膜。根据培养形式分为两大类：一类是细胞培养在中空纤维或毛细管内腔，另一类是细胞培养在膜外腔。临床治疗效果至少取决于三种因素，即细胞培养技术膜的特性和生物反应器的构型。
常见的生物反应器构型包括：（1）细胞培养在中空纤维腔内凝胶床中：Nyberg等于1992年提出将原代肝细胞和胶原凝胶混合后植入中空纤维管内，当凝胶收缩时在腔内形成一通道，利用此管道来增加细胞的营养，血液或血浆通过膜外循环，并产生第二个层流以减少血膜的界面与浓缩界面之间的阻力，也减少血凝块的形成；缺点是流动液体中的浓度级差可使凝胶深部的细胞营养不足和代谢产物累积。（2）细胞培养在中空纤维膜外：1972年Gullino等报告了分离的哺乳细胞能够成功地培养在中空纤维壁外，这些管排列在一个壳内，即壳一管构形，血液于管腔内循环灌注，血液中的毒性物质可通过半透膜而代谢，肝细胞分泌的营养成分进入血中。优点是细胞容易且很快地种植，细胞的植入量不受管内径的限制，因此细胞群和微载体附的肝细胞已培养在这型的生物反应器上，并且已商业化[12]。（3）细胞在毛细管膜编织的网间培养：这一生物反应器的概念于1993年由Gerlch等提出，其主要组成是用毛细管编织成垫，形成三个平面，每个平面呈90度角形成三维结构，三个平面分别运输氧、营养物质和血浆，肝细胞培养在管膜外，且可与细胞外基质或其它哺乳细胞共同培养[13]。已有报道，此种反应器的细胞密度可高达2.5×109/ml，细胞的功能达到5周之久[14]。优点是运输的氧将供给血浆，同时随着浓度差也可营养肝细胞。同样，营养物质亦能供给血浆中相当数量的细胞而不依赖于溶质的浓度。不同的膜垫组合，甚至在同一组中不同的膜垫，在不同的压力下可以促使通过细胞弥散对流来运输高分子量的溶质和迅速补给所消耗的溶质。溶质也随着单纯的弥散使其弥散能力极大地增强。然而这一现代化的装置至今没有得到临床应用，并且关于动物试验的效果知之甚少[12]。
3.3 血或血浆灌流
为了辅助生物肝的解毒功能，目前临床上试用的组合型人工肝多是用血浆分离后通过活性炭或树脂来吸附毒性物质再灌注到中空 纤维中。血浆通过灌流去除中、大分子物质。活性炭在早期的研究中易出现肺梗塞和出血倾向，以后出现了活性炭微囊以及将此微囊固定在氨基甲酸乙脂膜上等形式，使其发展较快。树脂对于有毒物质的清除有专一性能，因此是有前途的吸附材料。
4、组合型人工肝的动物试验与临床应用
尽管组合型人工肝有不同的类型，但基本结构是相似的，即血或血浆进入到含有肝细胞的生物反应器中，再返回到病人血中，其循环上再加上一个辅助解毒的装置。第一个临床试用组合型人工肝的是Matsumura，他于1987年报道了用血液透析装置内置兔的肝细胞，治疗了一例没有手术的胆管癌患者，使其胆红素下
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