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雷公藤碱戊对系统性红斑狼疮患者B细胞免疫功能的体外实验研究 |
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2.2 有丝分裂原 植物血凝素PHA-M(DIFCO,USA),美洲商陆PWM(SIGMA,USA),金葡菌Cowan-I株SAC(上海医科大学检验免疫室提供)。
1.3 方法
1.3.1 淋巴细胞增殖试验 人的肝素抗凝静脉血以淋巴细胞分离液分离PBMC，洗涤并重悬，细胞悬液配成2×106 个/ml，按每孔100 μl加至96孔细胞培养板中，同时加入有丝分裂原和碱戊，置5%CO2 37℃培养72 h，以3H-TdR掺入法测定细胞的增殖反应，以cpm值表示。
1.3.2 细胞毒性试验 取配制好的细胞悬液100 μl/孔加于96孔板内，同时加不同浓度的碱戊，培养48 h后加0.2％台盼蓝滴片计数活细胞百分率。
1.3.3 自发性淋巴细胞增殖试验 将分离并洗涤好的PBMC(2×106个/ml)悬液单独或与碱戊一起，置37℃ 5％ CO2培养箱中培养6 h，以3H-TdR掺入法测定细胞增殖量，以cpm值表示。
1.3.4 IgG的产生与检测 分离并充分洗涤好的PBMC悬液(2×106 个/ml)与PWM(10 μg/ml)共育，并加入碱戊，置37℃ 5％ CO2培养箱中培养7 d后收集上清，置－70℃冰箱保存待测。IgG的含量(ng/ml)则以酶联免疫吸附法测定。
2 结果
2.1 碱戊对正常人和SLE患者的PBMC自发性增殖的影响 SLE患者PBMC在体外的自发增殖反应明显增高，其3H-TdR掺入量平均为362.5±187.0，约为正常人(3H-TdR掺入量为177.6±187.0)的2倍(P＜0.05)。而碱戊(10 μg/ml)能明显抑制SLE患者PBMC的自发性淋巴细胞增殖反应，其3H-TdR掺入量为169.6±27.0(P＜0.05)。但对于正常人的自发性淋转无明显抑制作用，其3H-TdR掺入量为251.0±126.0(P＞0.05)。 为了排除药物本身毒性的影响，我们对碱戊进行了细胞毒性研究，结果发现在所用的实验浓度下(10 μg/ml)碱戊对细胞无直接的毒性作用，它们的存活率分别为：对照组91.0%±2.6％，碱戊组89.0%±6.3％，两组间的差别无显著意义(P＞0.05)。进一步以10倍的试验浓度做毒性试验发现碱戊对细胞也无直接毒性作用，对照组存活率为91.0%±2.6%,碱戊组为89.3%±4.8%(P＞0.05)。
2.2 碱戊对正常人及SLE患者SAC诱导的B细胞增殖反应的影响 如表1所示，碱戊对正常人及SLE患者的B细胞增殖反应均具有明显的抑制作用，它的抑制率在正常人与SLE患者之间分别为67.12%±24％,62.63%±24％(P＞0.05)。
2.3 碱戊对PWM诱导的PBMC分泌IgG的影响 SLE的PBMC在未受刺激时IgG的分泌量明显高于正常对照，而经PWM刺激后IgG的分泌量均明显增高，碱戊对正常人和SLE病人的PBMC在PWM刺激下的IgG分泌均有明显的抑制作用，其抑制率分别为53.86%±16％和58.90%±6％，两者之间无明显差异(P＞0.05)，见表2。进一步观察它们作用的时效关系发现分别在培养的0、24、48、72 h加入碱戊均能抑制PWM诱导的PBMC的IgG产生，结果分别为对照组1 237.2±782 ng/ml，0 h组405.0±179 ng/ml,24 h组468.5±276 ng/ml,48 h组为318.6±185 ng/ml,72 h组为310.4±123 ng/ml(P＜0.05)，而在培养96 h以后加入碱戊则不呈现抑制作用(P＞0.05),IgG的分泌量分别为96 h组1 221.0±978 ng/ml,120 h组1 203.0±811 ng/ml。
表1 雷公藤碱戊对SAC激发PBMC增殖反应的影响(n=10)
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