nNOS片段在大肠杆菌中的表达及特异性抗体的制备

陈　强　朱敏生　沈　月　许祥裕　潘　英　朱东亚　丁树标　智　刚　Kim S Lau　James T Stull

　　中国图书分类号　R392-33
　　摘　要　目的：为了制备nNOS特异性抗体。方法：用PCR的方法克隆出nNOS 708～881 aa片段的编码基因并将之插入pET28a原核表达载体。结果：成功地在大肠杆菌中获得高效表达。经HisTag-Sepharose和电泳回收法得到纯蛋白，将此蛋白免疫兔，制备出nNOS特异性抗体，抗体效价可达1∶8 000。利用该抗体成功地检测了正常肌肉和DMD肌肉中nNOS的含量变化，证实DMD肌肉中nNOS的含量明显低于正常肌肉。结论：制备的抗体具有较高的特异性，对nNOS的免疫检测具有重要应用价值。
　　关键词　nNOS　特异性抗体　重组表达　肌肉

Recombinant expression of nNOS fragment in E.coli and preparation of specific antibody against nNOS

CHEN Qiang,ZHU Min-Sheng,SHEN Yue et al.
Nanjing Military Institute of Medical Science,Nanjing 210002

Abstract Objective：To prepare the specific antibody against nNOS.Methods：Cloned a gene fragment coding 708 to 881 aa of nNOS with PCR and inserted the fragment into a pET28a expression vector.Results:Recombinant protein was expressed effectively in E.coli and purified with HisTag-Sepharose and electrophoresis.Using the pure protein as antigen,immunized rabbits and obtained high specific and high titer(1∶8 000) antibody against nNOS. Western blot assay showed that nNOS expressed in normal skeletal muscle is much higher than that in DMD skeletal muscle.Conclusion:The anti-nNOS antibody with a good specificity was prepared and the antibody was useful for immunological detecteion of nNOS
　　Key words nNOS Specific antibody Recombinant expression Skeletal muscle

　　一氧化氮合酶(NOS)有3种同工酶，即诱生型(iNOS)、内皮细胞型(eNOS)和脑型(nNOS)，它们均以L-精氨酸(L-Arg)为底物，在黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)等辅助因子的作用下生成L-胍氨酸和一氧化氮(NO)［1，2］。nNOS主要分布于小脑、骨骼肌、外周氮能神经、交感神经、肾上腺、脊髓的某些区域等部位。nNOS的表达异常与某些疾病密切相关，如神经、肌肉疾病等［3，4］。在nNOS的研究中，特异性抗体是非常重要的研究工具，由于nNOS与其他NOS之间存在有较高的同源性，且分子量较大(160 kD)，这就给nNOS抗体的制备带来较大困难。目前国外采用多肽合成的方法成功地制备了nNOS特异性抗体。我们通过基因工程的方法表达了nNOS特异性区域，并制备出了高效价的特异性抗体。

1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　质粒和菌种　pCMV/nNOS质粒，内含大鼠nNOS全长cDNA，由美国德克萨斯大学西南医学中心提供，pET/28a(+)表达载体购自Novegen公司，pGEM/3z质粒购于Promega公司。BL21及JM109宿主菌由本实验室保存。
1.1.2　酶和蛋白质及常用试剂　各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶等分别购自Boehriger公司、Promega公司、华美生物工程公司。Lambda

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