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V79和V798细胞周期及其调控因子的差异比较 |
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江 虹 冯 洁 王永潮
(北京师范大学生物系细胞增殖与调控生物学开放实验室，北京 100875)
摘 要 为了解V79和V79-8两种细胞周期及调控因子的差异，用［3H］胸腺嘧啶核苷参入法检测两种细胞，发现V79细胞无可检测到的G2期；V79-8细胞则同时缺乏可检测到的G1和G2期。流式细胞光度术显示，V79G1期细胞明显多于V79-8，表明两者在G1期调控上存在差异。比较两者G1期周期调控因子的mRNA表达水平发现，V79-8cyclin D1,cyclin D3和Id表达水平明显高于V79，这可能直接导致了两者G1的差异。
关键词 V79细胞 V79-8细胞 细胞周期调控 周期蛋白 周期蛋白依赖激酶
V79和V79-8为两种增殖速度非常快的中国仓鼠肺成纤维细胞系(Chinese hamster lung fibroblast)，它们的倍增时间分别为12.5h和9.5h。V79最初由Ford和Yerganian于1958年建系，而V79-8是由Elkind和Sutton于1960年从母细胞系V79转化而来。70～80年代，用［3H］胸腺嘧啶核苷参入法证实，V79细胞无可检测到的G2期；V79-8细胞则同时缺乏可检测到的G1和G2期［1，2］，但并没有对其细胞周期调控(cell cycle regulation)的分子机制做更为深入的研究。
我们利用现有的在细胞周期G1期中起关键作用的CDK、cyclin、Id等基因为探针，对它们在V79、V79-8细胞的mRNA表达水平进行比较，以期对其周期调控有更为深入的了解。我们的结果表明：V79-8细胞中cyclin D1、cyclin D3和Id的RNA表达水平明显高于V79细胞，这可能直接导致了这两种细胞在G1期调控的差异。
材料和方法
1.细胞培养
V79细胞由上海细胞所细胞库提供，V79-8细胞由M D Anderson肿瘤中心Rao PN博士赠送，均培养于DMEM(GIBCO BRL)培养基(10%小牛血清，105IU/L青霉素，100mg/L链霉素)，37℃，5%CO2的孵育箱中。
2.流式细胞光度术(FCM)
细胞经胰酶消化后，用冰冷的PBS洗，然后在80%乙醇-20℃固定，12h后，样品用冰冷的PBS洗3次，加入200mg/L无DNase的RNase，37℃保温30min，之后加入1g/L的溴化丙啶(propidium iodide,PI Sigma公司)，37℃保温30min，样品4℃避光保存，并在24h内测量［3］。
3.Northern杂交(Northern bolotting)
细胞总RNA用异硫氰酸胍一步法提取［4］，上样量为15μg，甲醛变性凝胶电泳后，真空转移至尼龙膜上［5］，杂交所用探针为自制的体外转录［α-32P］rUTP 标记单链反义RNA(Promega,Technical Manual)，其载体、RNA聚合酶及转录本长度如下：pGEM3z-β-actin-sp6-0.56kb;pSK-CDK4-T3-1.3kb;pGEM4z-CycD1-sp6-1.14kb;pXJ41-CycD3(antisense)-T7-1.96kb;pSK-Id-T7-0.93kb。
结果
细胞流式光度术的结果表明V79比V79-8的G1期细胞多了17%，这说明两者在G1期的调控上存在明显差别(图1)。
从Northern杂交的结果可以看出，V79-8细胞中cyclin D1、cyclin D3和Id的mRNA表达水平明显高于V79细胞，而CDK4的表达无明显差别。这些基因高水平的表达可能造成V79-8细胞中DNA合成在M期结束后马上开始，从而使细胞增殖速度加快，细胞始终处于快速增殖的状态，在周期时相上表现为G1期缩短以至难以检测(图2)。
图1 V79和V79-8细胞的流式细胞光度术曲线
Fig.1 FCM curves of V79 and V79-8cells
A:V79； B：V79-8
图2 V79和V79-8细胞中cyclin D1、cyclin D3、CDK4、Id基因的Northern
杂交分析
RNA探针：1.cyclin D1 2.cycl[1] [2] 下一页
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