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腺病毒载体介导的人类B7 1基因修饰的肿瘤细胞疫苗 |
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刘雪丰 张连峰 鞠丽梅 曾 苹 马耀文 李万波 蔡有余
(中国协和医科大学 中国医学科学院实验动物研究所，北京 100021)
摘 要 为了证明腺病毒载体可做为将B7基因导入肿瘤细胞的替代载体，达到提高肿瘤细胞疫苗效应的目的，且不存在逆转录病毒载体的局限性，用同源重组的方法构建了表达人类B7.1cDNA的重组人类5型腺病毒(AdB7.1)，并用它感染小鼠乳腺癌细胞系EMF\-6和大鼠神经胶质瘤细胞系C6，检测B7.1基因在感染过的肿瘤细胞中的表达；用AdB7.1感染过的肿瘤细胞给同基因宿主(BALB/c小鼠和Wistar大鼠)接种，观察它们在体内的致瘤性及对肿瘤的防治作用；用51Cr-释放法对用各种肿瘤细胞免疫后3周的动物脾淋巴细胞进行CTLs杀伤活性的测定，来检测其细胞免疫活性。结果的Northern blot分析表明：AdB7.1感染过的肿瘤细胞表达了B7.1基因。接种/侵袭实验和CTLs杀伤活性的测定实验表明，与野生型肿瘤细胞相比，表达B7.1的肿瘤细胞在动物体内的致瘤性降低(P＜0.01)，能诱导针对野生型肿瘤的高水平的系统性免疫应答和细胞毒T细胞活性，对肿瘤也有一定的防治作用。本研究的结论是，腺病毒载体可代替逆转录病毒载体将B7.1基因导入肿瘤细胞，提高肿瘤细胞疫苗的抗肿瘤作用。它操作简单，感染效率高，避免了使用逆转录病毒载体的局限性。
关键词 腺病毒载体 B7.1 肿瘤细胞疫苗
机体对肿瘤的免疫主要是细胞免疫，抗肿瘤免疫治疗的目的就是要诱导一个能有效消除散布肿瘤的T细胞免疫应答。近来的研究工作已证明，除了由T细胞受体传递的抗原特异的信号外，由T细胞表面分子CD28传递的共刺激信号对T细胞的完全激活也是必要的。由CD28介导的共刺激信号对分泌IL-2的CD4+的效应细胞的产生和CD8+的细胞毒T细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)产生是必要的［1，2］。B7是CD28的配体，在被抗原呈递细胞(antigen presenting cells,APCs)表达时可提供对T细胞的共刺激［3］，该分子被命名为CD80或B7.1，并表明是共刺激配体B7基因家族的成员，该家族也包括B7.2［4，5］。
在动物模型上的研究表明，用逆转录病毒载体将B7.1基因导入肿瘤细胞在动物体内诱导了特异而长期的抗肿瘤免疫应答［6～8］。然而逆转录病毒载体的低效性和细胞转染后的操作限制了这一方法的临床应用。腺病毒载体由于其诸多的优点［9］，可做为将B7.1基因导入肿瘤细胞的替代载体。在这一研究中，我们构建了表达人类B7.1的重组腺病毒载体(AdB7.1)，并用它感染小鼠乳腺癌细胞系EMF6和大鼠神经胶质瘤细胞系C6。Northern blot分析表明B7.1基因在这两种细胞中均得以表达。用表达B7.1的肿瘤细胞接种于同基因宿主，观察它们在动物体内的致瘤性及对肿瘤的防治作用，结果表明：与野生型肿瘤细胞相比，表达B7.1的肿瘤细胞在动物体内的致瘤性明显下降(P＜0.01)，且能诱导针对野生型肿瘤细胞的系统性免疫应答和高水平CTLs活性，对肿瘤有一定的防治作用。
材料和方法
1. 腺病毒载体的构建(图1)
图1 表达人类B7.1基因的重组5型腺病毒载体的构建策略
(步骤1～4参见材料与方法中的概述)
Fig.1 Construction strategy of rAd5 vectors expressing human B7.1 cDNA.Number 1-4 refer to the steps as outlined in Materials and Methods.
1.1 piln-B7.1长约3.5kb，携带B7.1cDNA，是在MC1060中表达的逆转录病毒载体质粒，B7.1cDNA长约857bp(美国Pharmaceutical Research Institute 的Bill Brady博士惠赠)。用EcolR Ⅰ和BamH Ⅰ对该质粒进行双酶切，得到含有B7.1cDNA的长达1.8kb的片段。
1.2 PAdE1CMV,长7.64kb，是带有腺病毒左端0～1.6μm(其中位于1.3～9.2μm的E1区缺失)的穿梭质粒(美国Baxter基因治疗部分子生物学研究室的张维维博士惠赠)。用Hpa Ⅰ将该质粒切成线状。
1.3 用T4噬菌体DNA连接酶把含有B7.1cDNA的片段与线状的[1] [2] 下一页
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