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腺病毒载体介导的人类B7 1基因修饰的肿瘤细胞疫苗 |
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pAdE1CMV连接起来，形成环状的pAdE1CMV-B7.1。
1.4 PJM17，克隆了5型腺病毒基因组(其中E3区缺失)的质粒(加拿大Micribix Biosystems In)。用pAdE1CMV与PJM17共转染293细胞，经同源重组产生含有B7.1cDNA的重组腺病毒AdB7.1。共转染所用的Lipofectin试剂盒购自Gibico BRL公司，按试剂盒上的说明书操作。按文献［10］所述的方法纯化蚀斑，PCR鉴定阳性蚀斑，然后扩增和测定滴度［11］。所用的B7.1特异引物为5′-ATGTCGACATGGTTATCCACGTGA-3′和5′-GAGGATCCTTATATACTAGGTGTAG-3′，腺病毒载体特异的引物为5′-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3′和5′-ATCTGAACTCAAAGGGTGG-3′。为了简化，图1仅显示了AdB7.1的构建过程。含有报告基因LacZ的重组腺病毒载体AdLacZ也以类似的步骤同时构建，做为对照。LacZ重组腺病毒载体的鉴定采用X-gal染色法［12］。
2. 体外感染
EMF6来自BALB/c小鼠的乳腺癌细胞系，本室冻存。C6来自Wistar大鼠的神经胶质瘤细胞系，本室冻存。于感染前1d接种一定数量的细胞，按一定的感染强度(multiplicity of infection,MOI)计算所需病毒量，用PBS稀释至一定体积(0.5ml/60mm平皿)。感染时，弃去原培养液，加上一定体积的稀释好的病毒悬液，室温下作用1h，每间隔5min摇晃1次。之后加入完全培养基，放入37℃孵箱，培养48h。
3. Northern blot检测B7.1mRNA的表达
用酸性胍-苯酚-氯仿一步法提取肿瘤细胞总RNA，取30μg甲醛变性胶电泳后，转到硝酸纤维素膜上，预杂交后与经α-32P标记的B7.1探针杂交、洗膜、放射自显影。
4.动物接种实验
BALB/c小鼠，4～6周。Wistar大鼠，3周龄，体重70g，均购于本所繁育场。收集待接种的细胞，用生理盐水洗2次，最后悬于生理盐水中。用4号针头分别接种到鼠的腋窝或腹股沟皮下。对免疫接种或免疫治疗用的肿瘤细胞要首先用300mg/L的丝裂霉素C处理1h，然后用生理盐水洗2次，最后悬于生理盐水中，接种动物。每周测量1次肿瘤的生长情况。用测径器测瘤块的2个互相垂直的直径，把两者相加，然后除以2来计算肿瘤的大小。
5. 用51Cr释放法检测CTLs的杀伤活性
将与动物接种相同的肿瘤细胞用300mg/L的丝裂霉素C处理1h，洗后做为刺激细胞(S)。用被接种3～4周后的动物的脾淋巴细胞作为反应细胞(R)。以R/S为100/1的比例将反应细胞与刺激细胞共培养(PRMI1640，10%小牛血清)5d，收获脾细胞。以相应的野生型肿瘤细胞为靶细胞(T)，用150mCi/L的51Cr(购于 Amersham，U.K.)标记靶细胞1h，洗涤后按不同的比例与反应细胞混合培养，18h后，用γ计数器测定上清中51Cr的量，按下式计算细胞毒活性：
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