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虎杖甙对正常人血管平滑肌细胞内钙和膜电位的调节作用 |
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r system might regulate negatively IP3 receptor system. And polydatin might induce the entry of sodium ion into cells and cause the depolarization of VSMC.
MeSH Muscle,smooth,vessels;Calcium;Membrane potentials
以往动物实验［1～3］发现虎杖甙(polydatin,PD)具有调节血管口径、改善微循环灌流等功效，对休克病人治疗也有显著疗效。但对正常人血管的作用及其机制不完全清楚。本研究用激光共聚焦显微镜观察PD对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)内钙离子浓度(［Ca2＋］i)和膜电位的影响以探讨其对人血管的调节机制。
材料与方法
(一)材料：人脐带取自南方医院妇产科，虎杖甙由本校化学教研室提纯制备，用D-Hanks液配，终浓度为0.5 mmol／L)。荧光探针Fluo-3-AM(测钙)、DiBAC4(3)(测膜电位)(美国Molecular Probe公司)，激光共聚焦显微镜570型(ALAS570，美国Meridian公司)，河豚毒素(TTX,Sigma),其它为国产试剂。EGTA、维拉帕米、TTX、优降糖、利及丁、甲氰咪胍、肝素和普鲁卡因均用D-Hanks液分别配制成2 mmol／L、50 μmol／L、2.5 μmol／L、2.5μmol／L、250 mg／L、2.5 g／L、765×103U／L、10 mmol／L。
(二)方法：
1.人脐带VSMC分离：无菌剥离一段脐带动脉，去除内、外膜，将血管切成约1 mm2大小贴入培养瓶，加入含10%小牛血清的DMEM培养基，倒置3～5 h翻转，于37℃、体积分数为5%CO2的细胞培养箱中静置3 d,然后每2 d换液。取3～8代细胞做实验。
2.荧光染料配制：Fluo-3-AM和DiBAC4(3)用含20 mmol／L HEPES的无血清DMEM缓冲液分别配成10μmol/L和5μmol/L，-20℃避光保存。
3.VSMC的荧光染色测定：实验前2 d将VSMC传代至测定小皿上，测定前用无血清DMEM缓冲液洗涤小皿2～3遍，加入荧光染料2滴，37℃避光温育30～60 min，再用缓冲液洗3遍(测膜电位不用洗，保留染料)，即可上机测定。
4.VSMC内游离钙、膜电位的测定［4，5］：利用特异荧光染料，ACAS 570可敏感检测可贴壁粘附活细胞的［Ca2＋］i和膜电位的动态变化。在488 nm波长蓝色激光激发下Fluo-3产生的荧光强度与细胞［Ca2＋］i浓度成正比；而根据DiBAC4(3)在细胞内外的重新分布可以判断出细胞膜电位的变化，当DiBAC4(3)进入细胞内增多，荧光增强时，表明细胞膜电位负值减小，出现去极化。
5.实验分组：实验设对照组、PD组、阻断剂处理组(加EGTA、维拉帕米、TTX等阻断剂预先孵育10 min再加PD处理)，分别测定加入PD后10 min内VSMC内钙离子浓度和膜电位的动态变化。
(三)数据处理：数据经ACAS-570微机系统对图形及时间进行实时测量而获得，以未加PD处理前的荧光值为100(%)，以均数±标准差表示，数据以student s t检验进行显著性分析。
结果
一、PD对细胞［Ca2＋］i及膜电位的影响：
单纯加PD后，平滑肌细胞［Ca2＋］i立即升高，1 min细胞［Ca2＋］i即增加(29±2.8)%，10 min后细胞［Ca2＋］i增至(56±5.6)%(与初始值相比，P＜0.01，n=3)(图1)。而正常细胞膜电位在加入PD后出现负值减小［细胞内荧光强度10 min后增加(13.2±1.9)%］(与初始值相比，P＜0.05，n=5),见(图3)。
Fig 1 The effects of polydatin on intracellular free calcium of vascular smooth muscle cells (±s，n=3) **P＜0.01,vs control group
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