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山茱萸总甙对HUVEC表达ICAM |
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李建民 周勇 张丽 高杰英 赵世萍 付桂香 王旭丹
中国图书分类号 R392.11 R967
血管内皮细胞的活化在炎症疾病过程中起着重要作用,活化的血管内皮细胞可以表达粘附 分子如ICAM-1和CD44,使中性粒细胞和淋巴细胞与其粘附、穿越内皮而进入炎症部位,研究 表 明中性粒细胞可通过其膜表面表达的配体与ICAM-1相互作用而粘附于血管内皮细胞的表面, C D44在炎症组织表达增高［1］,并且也与中性粒细胞的侵润有关。我们的初步研究 发现:从山茱 萸中提取的总甙类物质具有免疫抑制作用,为了深入探讨其机理,本实验应用Cell-ELISA方 法 研究山茱萸总甙(Total Glycosides from Cornus Officinalis,TGCO)对促炎性细胞因子IL -1和TNF-α诱导人血管内皮细胞系ECV304表达ICAM-1和CD44的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 DME培养基GIBCO公司产品, 使用时加入青霉素100 U/ml， 链霉素100 μg/ml和20% 新生小牛血清。胰蛋白酶为Sigma产品，胰蛋白酶用0.9%的生理盐水配成0.25%浓度与0.0 3% EDTA按1:1混匀消化细胞。rIL-1、rTNF-α、BSA、Tween-20、TMB、HRP羊抗鼠IgG抗体购 于北 京邦定公司，anti-ICAM-1（鼠抗人1：3 000）和anti-CD44（鼠抗人1：3000）单抗，由 军事 医学科学院微生物流行病研究所免疫室罗振革博士和孔祥英老师惠赠，其它为国产分析纯。
1.1.2 药物 地塞米松5 mg/ml,天津市氨基酸公司 人民制药厂，批号:990512。山茱萸总甙由中日友好医院临研所赵世萍提供。
1.2 方法
1.2.1 血管内皮细胞系ECV304的传代培养 EVC304细胞系为安贞医院细 胞免疫室培养，本 室引进后传代培养，调整细胞浓度为2×105分种于1%明胶预包被的96孔板上，置37℃、5% CO 2条件下培养。至形成致密单层后，去除培养上清，冲洗后的EVC304单层用于ICAM-1、CD 44的表达。
1.2.2 山茱萸总甙对EVC304细胞系表达ICAM-1、CD44的影响 rIL-1 和rTNF-α诱导EVC304细胞系表达ICAM-1、CD44的比较： 在含有EVC3 04单层 的96孔内，分别加入rIL-1终浓度为100 U/ml、rTNF-α终浓度为400 U/ml和阴性对照组, 每 孔200 μl,每组重复8孔,诱导24 h；山茱萸总甙对ECV304细胞系表达ICAM-1、CD44的影响 ：同时分别设立rIL-1（ 终浓 度为100 U/ml ）、rTNF-α（终浓度为400 U/ml）与山茱萸总甙的不同剂量组（山茱萸总 甙的 终浓度分别为62.5、125、250 μg/ml）;地塞米松（终浓度为10 μg/ml）分别与r I L-1（ 终浓度为100 U/ml）和rTNF-α（终浓度为400 U/ml）组, 每孔200 μl，每组重复 8孔,同 时诱导、作用24 h，检测山茱萸总甙(TGCO)不同剂量和地塞米松(DEX)对血管内皮细胞表达I CAM-1、CD44的影响。
1.2.3 ICAM-1、CD44抗原的检测［2］ 上述EVC304单层，用pH 7.2的PBS冲洗2遍，用1%戊二 醛4℃固定30 min,用含0.05%Tween20的PBS洗板3次，用3%BSA、200 μl/孔，封闭37℃40 m in,洗 板（用含0.05%Tween20的PBS洗板3次）后加入鼠抗人anti-ICAM-1、anti-CD44抗体，50 μl/ 孔，37℃置1 h，洗板（用含0.05%Tween20的PBS洗板3次）后加HRP羊抗鼠IgG抗体(1:2 000 )1 00 μl/孔，37℃置1 h，洗板后加TMB-H202 100 μl/孔，37℃显色15 min,加100 μl 、1 mol/L H2SO4终止反应。450 nm处读取光密度值。
2 结果
2.1 山茱萸总甙对rTNF-α诱导ECV304表达ICAM-1和CD44的影响 结果表明：与未加rTNF-α诱导的阴性对照组相比, rTNF-α(400 U/ml)组可明显增加ECV 304 表达I[1] [2] [3] 下一页
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