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一个与非小细胞肺癌转移相关的基因 RAB5A基因 |
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基因是阐明癌转移机理的重要途径，这将有助于最终阐明癌细胞如何转移，以及为何发生转移，有助于寻找转移性癌细胞的特征性标志和人类控制癌转移的有效途径。
mRNA差异显示技术(DD)具有直观、快速、反映信息完整的优点，可直接在基因表达水平获得有价值的信息。我们采用此技术分析了具有相同细胞来源，但转移能力不同的两个人肺腺癌细胞系AGZY83-a和Anip973的基因差异表达情况，以此分离转移相关基因和与细胞表型相关的基因, 并获得RAB5A基因在具有高转移潜能的Anip973中高表达的证据和有关RAB5A高表达在临床肺肿瘤中存在的意义。初步证实RAB5A可以作为一个非小细胞肺癌转移相关的基因。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系 低转移性人肺腺癌细胞系AGZY83-a和由AGZY83-a中筛选出的高转移性亚系Anip973，均由哈尔滨医科大学王吾如教授提供。经接种裸鼠证实，Anip973具有高转移潜能，而AGZY83-a无转移潜能。
1.1.2 肺癌手术标本 17例手术取材的非小细胞肺癌组织，邻近淋巴结和癌旁正常肺组织来自哈尔滨医科大学附属第二医院病理科，33例非小细胞肺癌的石蜡切片来自哈尔滨医科大学附属第三医院病理科，以上病例均为随机收集。
1.1.3 试剂 总RNA提取试剂盒(Promega, Gibco BRL公司)，cDNA逆转录合成试剂盒(Gibco BRL)，cDNA第一链合成引物(中国科学院上海细胞生物所)，DD10mer引物(Operon)，Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer)，荧光染料SYBRTM GREEN1(FMC), PGEM-T Vector(Promega)，JM109(Promega)感受态按常规自制。5 RACE试剂盒(Gibco BRL)，RAB5A一抗(Santa)，S－P及检测试剂盒(福州麦新生物公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 细胞系生长于RPMD1640培养基中，待至80％～70％汇合时，收获细胞提取总RNA。
1.2.2 mRNA DD，差异片段回收及克隆产物鉴定 参照Liang P 和 Ito〔1, 2〕等方法，详见参考文献〔3〕。
1.2.3 差异片段克隆产物序列分析及再鉴定 以获得的纯化质粒为探针，按标准的Northern印迹杂交方法检测2个细胞系基因表达情况，应用ABI 373A DNA自动测序仪，按ABI公司克隆测序试剂盒提供的方法。对纯化质粒进行序列分析，将获得的DNA序列与 GenBank已知序列进行同源性比较。并根据测序分析的结果，重新设计序列内部特异引物, 进行Nest-PCR，对克隆质粒，回收的PCR产物进行再证实及通过Oligo-dT反转录合成cDNA第一链，RT-PCR确认基因的表达改变。
1.2.4 同源性比较和克隆测序 根据同源性比较结果调取两细胞系A15全长cDNA，方法按5 RACE试剂盒推荐的方法进行，克隆测序比较两细胞系RAB5A序列无改变。
1.2.5 肺癌手术标本RT－PCR 收集新鲜肺癌手术标本(肺癌组织，自体淋巴结，癌旁正常肺组织)，提取总RNA，电泳检样，并经紫外分光光度计定量，以oligo-dT 为引物，反转录合成cDNA第一链，以特异引物为引物，常规RT-PCR，产物经2％琼脂糖凝胶电泳检样。
1.2.6 免疫组化分析 细胞系采用免疫荧光组化分析，肺癌石蜡切片采用娒庖咦榛疍AB染色法，操作按试剂盒推荐方法略加改进。
结果判定：(1) FITC荧光检测阳性可见细胞膜存在有绿色荧光，(2) DAB染色则根据在细胞质及细胞膜附近出现棕黄色颗粒为阳性，随机计数5个高倍镜（×40）视野中阳性细胞百分率。根据阳性细胞数目，分为阴性（－）：阳性细胞数0％～24％；阳性（＋）：阳性细胞数为25％～74％；阳性（＋＋）：阳性细胞数 ≥75％。
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