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利用原位杂交分析几种cyclin和CDK基因在人乳腺癌中的异常表达 |
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们选取乳腺癌为材料，利用RNA原位杂交技术，比较分析了cyclinD1、cyclinD3、cyclinE、CDK2和CDK4 mRNA在正常乳腺及乳腺癌组织中的表达水平。
材料和方法
1.实验材料
从外科手术中收集了20例乳腺癌组织样本，为了表明cyclin和CDK基因与乳腺细胞癌变的关系，主要收集早期乳腺癌标本，其中16例按TNM分期法为Ⅰ期，4例为Ⅱ期，还收集了3例正常乳腺组织样本。收集后立即用OCT胶包埋，置于液氮中冷却，然后保存在-70℃冰箱中。
2.质粒构建
cyclinD1、cyclinD3、CDK2和CDK4基因cDNA由美国Cold Spring Harbor实验室的David Beach博士惠赠，cyclinE基因cDNA由美国Scripps研究所的Steve Reed博士惠赠。
本研究是利用体外转录获取DIG标记的RNA作为探针，这样基因片段需插入具RNA聚合酶启动子的质粒上。cyclinE、CDK2和CDK4的cDNA连接在含有RNA聚合酶启动子的pBluescript SK质粒上，符合要求。cyclinD1和cyclinD3最初连接在不含RNA聚合酶启动子的pUC118质粒上，因此需将它们重新构建到含启动子的pGEM3Z质粒上。根据酶切位点，cyclinD1用E.CoR Ⅰ和HindⅢ双酶切(1.14kb),cyclinD3用E.CoR Ⅰ和XbaⅠ双酶切(1.44kb)，同时用相同的酶切pGEM3Z质粒，然后将酶切片段分别连接到质粒上(图1显示cyclinD1重组质粒的构建，cyclinD3以相同的方式构建)。
图1 重组质粒构建示意
Fig.1 Construction of recombinant plasmid pGEM3Z-cyclin D1
3.合成DIG标记的探针
首先，选择适当的酶切位点，将含各基因cDNA的质粒线性化，它们分别是E.CoRⅠ(cyclinD1、cyclinD3和CDK)、BamHI(cyclinE)、HindⅢ(CDK2)。然后确定转录合成RNA探针的RNA聚合酶，它们分别是SP6(cyclinD1、cyclinD3和CDK4)，T3(CDK2和CDK4)，T7(cyclinE)。利用德国Boehringer Mannheim公司生产的试剂盒合成DIG标记的反义及正义RNA。标记方法依据试剂盒所附使用说明书。由于最初合成的RNA片段较大，利用NaHCO3和Na2CO3将它们分解成约300个碱基的片段。
4.原位杂交
冷冻切片厚10μm，切片的固定、预处理，探针杂交及显色等主要参考《原位杂交》［5］及试剂盒说明书介绍的方法。各组织样品不仅用反义RNA探针进行杂交，同时也用正义RNA探针或不加探针作为对照。镜下观察、比较正常组织和癌组织的显色结果。
结 果
原位分子杂交结果显示(附表)，部分或大部分乳腺癌标本的癌细胞中不同程度地表达3种cyclin和2种CDK基因。根据阳性标本的相对显色程度，将它们分为强阳性、中阳性和弱阳性。cyclinD1和CDK4 mRNA的表达比例最高，并且高表达的程度也最大，中等以上阳性显色分别为17例和14例(阳性显色程度代表着mRNA表达水平)。约一半样品呈cyclinD3 mRNA高表达，但程度低于cyclinD1和CDK4。cyclinE和CDK2阳性的样品较少，出现阳性显色的也多为弱阳性。对于每一个病例样品来说，没有发现5种基因均为高表达的。均无高表达的2例，多数为1～3基因呈现高表达。
各基因在样品中的显色结果见图2～9，显色最强的是cyclinD1和CDK4，其次是cyclinD3，较弱的是cyclinE和CDK2。所有基因在正常组织中均为阴性显色，仅见部分导管细胞呈cyclinD1弱阳性。
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