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孤儿肽在自发性高血压大鼠和家兔心血管系统的分布 |
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分布，在外周组织如脾、胎儿肾、卵巢等也观察到了OFQ前体mRNA的表达［3～5］，但在心血管系统是否有OFQ分布尚未见报道。此外，最近的研究证明：经静脉或侧脑室注射OFQ可引起大鼠动脉压降低和抗钠利尿等功能［6，7］。本研究用RT-PCR和免疫组织化学方法分别对自发性高血压大鼠和家兔的心血管系统进行了研究，以观察心血管组织中是否有OFQ的分布，并为进一步探讨OFQ的心血管效应及作用机制提供参考。
材料和方法
1. RT-PCR
选用体重250g的自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)，雌雄不拘,(由北京阜外医院实验动物科提供)依据Chomczynski等［8］建立的一步法提取各组织的总RNA，采用紫外吸收法进行RNA定量，各组RNA样品的A260/A280nm吸光度比值均在1.8～2.0之间。将2μg的总RNA反转录成相应的cDNA。
据已报道的OFQ前体cDNA核甘酸序列［4］合成引物，正义链引物(sense primer)为：5′-T GGA TCC CAC GGC TGC ACC ATG AA-3′,+9～+23,反义链引物(antisense primer)为：5′-GAA TTC GGC TCC TTC TGG CTA CAC ATT AC-3′，+563～+591，由Sangon公司合成，此对引物的扩增片段长为585bp。PCR参照Martin等［9］建立的方法进行。PCR条件为：94℃变性1min，56℃退火1.5min，72℃延伸2.5min，扩增30个循环。取15μl PCR产物在含有溴化乙啶的1.5%的琼脂糖凝胶上电脉，电泳结果应用Doc1000分析仪(Bio-Rad公司)进行分析。
2. 免疫组织化学染色
抗兔OFQ抗体由美国Phoenix公司提供，免疫组织化学染色试剂盒购自北京华美生物工程公司。选用体重1.8kg家兔，1.3%戊巴比妥钠麻醉后取心，主动脉，肾和脑组织用中性福尔马林固定12h以上，冰冻切片，厚10μm，0.3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，0.1%胰蛋白酶修复抗原，25%小牛血清封片，上述各步间用PBS洗3×5min，以下染色程序按试剂盒要求进行。第一抗体的稀释度为1∶500。阴性对照省去一抗。
结果
1. RT-PCR结果
1.5%琼脂糖凝胶电脉后的影像显示：阴性对照(水)中未见任何扩增条带，心室组织未见585bp的条带，心房组织可观察到荧光信号较弱的585bp条带，主动脉、肺动脉、肾动脉和肾静脉组织均有585bp条带，其荧光信号的强度和带形与阳性对照脑组织近似，各组织内的内参照β-actin的荧光信号强度和带形一致(图1)。可见OFQ前体mRNA在主动脉、肺动脉、肾动脉和肾静脉组织均有较高表达，其表达量近似于脑组织，而在心房组织中，OFQ前体mRNA的表达水平较低。
图1 心血管系统OFQ前体mRNA的RT-PCR产物的琼脂糖
凝胶电泳结果：M.Marker,A.阳性对照(脑组织)，B.心房，C.心室，
D.主动脉，E.肺动脉，F.肾动脉，G.肾静脉，H.阴性对照(水)
Fig.1 Amplification of OFQ precursor mRNA in cardiovascular system by RT PCR.PCR products were
analyzed by agarose gel electrophoresis.M，molecular mass marker;A，positive control(brain);B，atrium;C，ventricle;D，aorta;E，pulmonary artery;F，renal artery,G，renal vein;H，negative control(water).
2.免疫组织化学染色结果
免疫反应细胞呈棕色，背底不着色或呈浅黄色。免疫组织化学染色结果与RT-PCR结果一致，并进一步确定了OFQ在各组织中的具体分布位置。在心房组织中内皮细胞呈OFQ免疫反应性，心肌细胞中未见OFQ免疫反应颗粒(图2)。主动脉组织中内皮细胞和平滑肌细胞呈OFQ免疫反应性(图3)，此外，肾脏血管内膜的内皮细胞和中膜的平滑肌细胞呈现OFQ阳性反应，在肾小球内也观察到了OFQ反应上一页 [1] [2] [3] 下一页
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