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大鼠三叉神经节及尾侧亚核内降钙素基因相关肽在面口部伤害性刺激时的动态变化 |
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武胜昔 王亚云 李云庆 施际武
(第四军医大学基础部解剖学教研室 梁钅 求琚脑研究中心，西安 710032)
摘要 为了探讨降钙素基因相关肽(CGRP)在面口部伤害性刺激条件下合成、运输和释放的规律，将福尔马林注入大鼠一侧口周皮下，分别于刺激后不同时间取材，用原位杂交和免疫组织化学方法观察CGRP mRNA及CGRP样阳性结构(CGRP－LI)在三叉神经节(TG)和三叉神经尾侧亚核(Vc)内的动态变化。原位杂交结果显示：TG内表达CGRP的两种亚型α－CGRP和β－CGRP mRNAs神经元的数量分别于富尔马林刺激后2h和4h有明显增加，8h达到高峰，然后渐下降，至48h后恢复至正常。免疫组织化学结果显示：Vc浅层CGRP－LI的含量在刺激后1h内明显减少，2h后渐增，12h达到高峰，24h后趋向正常。TG内CGRP－LI神经元的数量在刺激后1h内也明显减少，此后逐渐回升至正常并有轻度增加，但与正常间无明显差异。
关键词 降钙素基因相关肽α－CGRP mRNA β－CGRP mRNA 三叉神经尾侧亚核 三叉神经节 原位杂交组织化学 免疫组织化学
降钙素基因相关肽(CGRP)广泛分布于神经系统，免疫组织化学研究证明三叉神经尾侧亚核(Vc)及脊髓背角(SDH)中有浓密的CGRP样阳性纤维和终末，这些纤维和终末主要来自于三叉神经节(TG)和背根节(DRG)中CGRP样阳性的中、小神经元［1，2］。许多研究表明CGRP在外周伤害性刺激信息的传递中具有重要的作用［3～5］。α－CGRP和β－CGRP是利用分子克隆技术在大鼠脑内发现的两种CGRP亚型，它们的氨基酸序列差异很小，在大鼠仅有一个氨基酸不同［6］，两者在神经系统中的分布具有不同的特点［6，7］。我们以往的研究发现两种亚型的mRNA均可表达于TG神经元中，但表达神经元的类型存在一定差异［8］。目前，对两种亚型在功能上的区别还不清楚，它们是否都参与伤害性刺激信息的传递与不甚明了。
Vc是传递面口部伤害性刺激信息初级传入的终止部位，也是下行抑制系统的作用部位之一，在面口部伤害性刺激信息的传递及调控中具有重要的作用［9］。目前对痛和镇痛条件下Vc内神经活性物质变化规律的研究很少，而这些研究将对深入了解Vc在面口部痛信号的传递和调节中的作用具有重要意义。本研究用原位杂交及免疫组织化学技术，以福尔马林注入大鼠口周皮下作为急性痛模型，观察了CGRP两个亚型的mRNA和CGRP样阳性结构(CGRP－L)在TG及Vc中的时程变化规律，以进一步了解CGRP在面口部痛信息传递中的作用以及痛条件下CGRP的合成、运输、释放的规律。
材料和方法
1.动物准备
实验用200～250 g成年SD大鼠40只，随机分成2组，每组20只，分别用于原位杂交法和免疫组织化学研究。各组动物按给予福尔马林刺激后的存活时间分为9个实验组(0.5、1、2、4、8、12、24、48h和5d)，每组2只。每组的另2大鼠只用作2组的对照组。实验组大鼠用乙醚麻醉后，将10%福尔马林150 μl注入右侧口周皮下，注射完毕立即计时。对照组大鼠行相同麻醉后将150 μl生理盐水注射到右侧口周皮下。
2.原位杂交组织化学法
2.1 组织准备：各组大鼠达到规定存活时间后，戊巴比妥钠深麻，断头后快速取脑干和TG，立即包埋于干冰粉末中。恒冷箱切片机切片，片厚14 μm，贴于经明胶处理的载玻片上，-30℃冰箱中保存备用。对照组大鼠存活8h后取材，过程同上。
2.2 探针的制备及标记：α－CGRP和β－CGRP探针均为寡核苷酸探针，其序列分别与大鼠脑内各自相应的mRNA的一部分(自第664号碱基到第698号碱基和第656号碱基到第690号碱基)相互补［6］。探针用3′末端标记法及[α-35S]dATP[>1000 Ci/mmol,Amersham]进行标记。标记探针的特异性放射活性为2.3～2.8×109dpm/μg。
2.3 原位杂交组织化学步骤：切片快速干燥后依次入4%多聚甲醛，0.1 mol/L PB及杂交前处理液(含0.9%氯化钠，1.5%三乙醇胺和0.25%乙酸酐)。杂交时将200～300 μl杂交液［含4×SSC、50%甲酰胺、0.025% tRNA、10%硫酸苏糖、1×Denhardt液(含0[1] [2] 下一页
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