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bax基因在小鼠睾丸及实验性隐睾中表达的研究 |
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睾丸不能从腹腔下降至阴囊，术后3、6、8 d取材，每组动物12～15只。
2 试剂
兔抗小鼠Bax多抗、生物素化的山羊抗兔抗体、辣根酶标记链抗生物素(Santa Cruz Biotechnology公司，购于北京中山生物技术有限公司)，山羊血清(Vector Laboratories, Burlingame)，琼脂糖(agrose)、蛋白酶K(protein kinase)、Trizol(Sigma公司)，随机引物标记试剂盒(prime-a-gene-labeling system, Promega公司)，地高辛DNA标记和检测试剂盒(DIG DNA Labeling and Detection kit Boehringer Mannheim公司)，含小鼠bax基因cDNA片段的重组质粒由美国Washington University,Stanley J. Korsmeyer博士惠赠。
3.Western-blotting印迹法［5］
新鲜睾丸组织在冰上剪碎，加入适量新配蛋白提取液(脲0.3g，SDS 0.05g，DTT 0.125g，加去离子水5 ml溶解)，振荡器上振荡10 min，加NP-40至终浓度10%，振荡10 min，15 000 r/min，4℃ 20 min，取上清。考马斯亮蓝染色法测定蛋白含量。SDS-PAGE电泳，加样量25 μg，电流20～30 mA。剪大小完全吻合或稍小的硝酸纤维素膜及滤纸，作好标记，电转移过夜，电流65 mA／cm2。硝酸纤维素膜于1×丽春红S染液中染色15～30 min，蒸馏水中漂洗至显带清楚，切下相应部位的硝酸纤维素膜，蒸馏水中漂洗，1% BSA封闭液中室温封闭5 h。1∶500封闭液稀释的兔抗小鼠Bax多抗4℃过夜，PBS洗3次，10 min／次，1∶1 000封闭液稀释的生物素化的山羊抗兔抗体室温孵育2 h，PBS洗3次，10 min／次，1∶1 000PBS稀释的辣根酶标记链抗生物素室温孵育2h，PBS洗3次，10 min／次，新鲜配置的DAB显色液中显色，TE终止，摄片。
4.石蜡组织切片原位杂交及统计学分析
含小鼠bax基因cDNA片段的重组质粒用氯化钙法转化大肠杆菌DH5α菌株，碱裂解法进行质粒DNA的大量制备，PEG法纯化，限制性内切酶EcoRI消化，低熔点琼脂糖回收cDNA片段，测定A260和A280值，计算DNA浓度。bax基因cDNA探针用地高辛试剂盒标记和检测。睾丸组织4%中性福尔马林固定24h，常规石蜡包埋。6μm的石蜡组织切片以0.04%DEPC水裱贴于圆玻片上，52℃过夜烤干。新鲜二甲苯37℃ 30 min，室温10 min，梯度酒精脱水，PBS洗2次，5 min／次，新配的0.3% Tritonx-100 10 min,PBS洗2次，5 min／次，蛋白酶K(1 mg/L)37℃ 30 min，冷PBS洗3次，5 min／次，0.25%乙酸酐室温10 min，PBS洗2次，5 min／次。余下步骤按常规原位杂交方法操作，终止显色后梯度酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片，镜检并摄片。对照：以杂交液中免去探针作阴性对照。利用Pharmacia LKB Ultroscan XL激光密度扫描分析系统，对阳性杂交信号单位面积平均灰度进行半定量扫描分析，结果以“学生”NK检验(Student Newman-Keuls，SNK)进行统计学分析，P<0.05，为差异显著。
5.组织总RNA提取
新鲜或液氮中保存的睾丸组织在冰上剪碎，加适量Trizol试剂充分匀浆，吸管反复吹打均匀，室温放置5 min。每ml Trizol加入0.2 ml氯仿，振荡混匀15 s，室温放置5 min，4℃，10 000 r/min，15 min，转移上清，加入0.5 ml异丙醇，振荡混匀，室温放置10 min，4 ℃，10 000 r/min，15 min，弃上清，沉淀以75%乙醇洗涤后晾干，溶于50 μl DEPC水中。
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