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大黄酸对体外培养小鼠肾小球系膜细胞葡萄糖转运蛋白1表达及葡萄糖摄入的影响 |
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racellular matrix, ECM)合成增加是糖尿病肾病中肾小球硬化形成的关键因素〔2〕，GLUT1是肾小球系膜细胞主要的葡萄糖转运体，GLUT1在系膜细胞的过度表达使得过多的葡萄糖进入细胞，引起细胞糖代谢的紊乱，进而导致细胞外基质合成增加〔3，4〕。转化生长因子β1(TGFβ1)在糖尿病肾病的发生及发展中起重要作用，TGFβ1可以上调系膜细胞GLUT1的表达与葡萄糖的摄入〔5〕，因此，抑制TGFβ1介导的GLUT1在系膜细胞的过度表达是预防与治疗糖尿病肾病重要途径。
大黄酸(rhein， 4,5 dihydroxyanthraquinone-2-carboxylic acid)是中药大黄的一种主要成份，动物实验表明中药大黄及其提取物大黄酸可以抑制糖尿病大鼠肾脏的高代谢，明显减少尿蛋白，控制肾脏的肥大，但其作用机制并不清楚〔6，7〕。体外实验显示大黄酸可以抑制肿瘤细胞葡萄糖的摄入，影响其能量供应，而且大黄酸对系膜细胞的增殖也有抑制作用〔8，9〕。
为了研究大黄酸对糖尿病状态下系膜细胞糖代谢可能的影响，我们分别观察了大黄酸对正常培养条件下和TGFβ1刺激下系膜细胞GLUT1表达及葡萄糖摄入的影响。
材料和方法
一、材料
大黄酸由本研究所从中药大黄中提取，纯度大于95%；DMEM(低糖)购自Sigma公司；小牛血清购自四季青生物工程研究所；TGFβ1购自Promega公司；GLUT1 cDNA探针由美国华盛顿大学Mueckler博士惠赠；随机引物标记试剂盒来自Promega公司；2-deoxy-〔3H〕-D-Glucose购自Amersham公司。
二、系膜细胞培养
本实验采用的系膜细胞是从四周龄C57B1/6J×SJL/J小鼠肾小球分离克隆的系膜细胞系。所有实验均控制在25～35代细胞中进行。细胞在DMEM培养液中培养传代(20%小牛血清)。
三、RNA提取与Northern印迹
选70%融合的系膜细胞，用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA，取30μg RNA在含2.2mol/L甲醛的1%琼脂糖中电泳，毛细管法转印至尼龙膜上，80℃固定两小时，在预杂交液(5×SSPE，50%甲酰胺，5×Denhardt's液, 0.1%SDS,100μg/ml鲑鱼精子DNA)中42℃预杂交4小时，在含32P标记cDNA探针的杂交液(5×SSPE,50%甲酰胺，0.1%SDS，100μg/ml鲑鱼精子DNA)中42℃杂交18小时，2×SSC，0.1%SDS溶液室温洗三次，0.2×SSC，0.1%SDS溶液55℃洗一次，对X光片-70℃曝光48小时。GLUT1探针标记采用随机引物法。
四、系膜细胞葡萄糖摄入测定
系膜细胞接种二十四孔板中生长至70%融合，弃培养液，用20mmol/L HEPES(140mmol/L NaCl,1mmol/L CaCl2,5mmol/L KCl,2.5mmol/L MgSO4,20mmol/L HEPES,0.1%BSA,pH 7.4)洗三次，加入1ml 1μCi/ml 2-deoxy-〔3H〕-D_Glucose的HEPES液，37℃半小时，PBS洗三次，加1mmol/L NaOH作用两小时，盐酸中和至中性，加闪烁液5ml，液闪仪计数其cpm值。蛋白质浓度测定采用考马斯亮兰G250法。
结 果
一、大黄酸对生理葡萄糖浓度培养条件下系膜细胞葡萄糖摄入的影响
系膜细胞在生理葡萄糖浓度培养条件下生长至亚融和状态，分别加入50μg/ml和25μg/ml的大黄酸培养24小时，发现大黄酸对系膜细胞葡萄糖摄入无明显影响，与对照组葡萄糖摄入率(100%)相比则分别为90.39%及95.84%。
二、TGFβ1对肾小球系膜细胞葡萄糖摄入的影响
系膜细胞70%融合，用含1%血清培养液处理24小时，分别加0.5ng/ml,1.0ng/ml和2.0ng/ml的TGFβ1至1%血清的培养液中继续作用10小时，并以1%血清为对照，发现TGFβ1能显著增加系膜细胞葡萄糖摄入，以对照组摄入为1，则加0.5 ng/ml,1.0ng/ml,2.0ng/ml，各组葡萄糖摄入为2.82，2.87，4.28，其作用呈剂量依赖关系。
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