|
外周血单个核细胞与血清中HBV DNA及其变异比较 |
| |
郭亚兵 张继锁 侯金林 姜荣龙 杨云芬 章廉 顾小维 骆抗先
人外周血单个核细胞(PBMC)中存在HBV DNA［1］的生物学意义远未阐明。我们用动态观测PBMC中HBV DNA方法，研究PBMC中HBV DNA消长规律及其对干扰素的应答与疗效的影响。
材料与方法
一、病例来源
6例慢性乙型肝炎(乙肝)患者系1994年3月～1995年2月广州南方医院传染病科住院患者，男5例，女1例，平均年龄24.4岁(10～31岁)。均经肝穿刺活检病理诊断。6例血清HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBV DNA(+)、抗-HCV(—)。α-干扰素(Schering Plough,美国)治疗方案：3～6百万单位(MU)，每周3次，皮下注射，疗程3～6个月。外周血标本于治疗前后各1次、治疗中每间隔4～6周采集1次。
二、方法
(一) PBMC分离 肝素抗凝全血5～10ml，加等量140mmol/L NaCl稀释后铺于淋巴细胞分离液上，400g离心30分钟，取中间层细胞，用5ml生理盐水洗细胞3～4次。
(二) PBMC中HBV DNA检测 参照文献［2］方法提取细胞DNA。将细胞悬于细胞裂解液中(10mmol/L Tris.HCl pH8.2,100mmol/L EDTA pH8.0,0.5%SDS,20μg/ ml RNase)，37°C 1小时，加100μg/ ml蛋白酶K，50°C3小时，以苯酚、氯仿抽提，乙醇沉淀。DNA沉淀溶于20μl ddH2O。取1μl DNA，用引物C1/C3进行PCR检测。即于标准PCR缓冲液中，加dNTP各200μmol，引物对各25pmol，总体积50μl,94°C 2分钟后加2.5U Taq DNA聚合酶。进行30～35次热循环：94°C 40秒，54°C 40秒，70°C 80秒；最后70°C 5分钟。取5μl PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，于预测相对分子质量665bp处有明显荧光带者为阳性结果。
(三) 血清HBV DNA检测 血清DNA提取参照文献［3］方法略修改：100μl血清，加100μl裂解液(25mmol/L,2.5mmol/L EDTA,1%SDS,2mg/ml proteinase K,10μl/ml tRNA)，68°C 2小时，酚和氯仿抽提，乙醇沉淀后，溶于10μl ddH2O，取5μl进行PCR检测，方法同上。
(四) HBV前C/C区核酸序列分析 引物序列见表1。用双脱氧末端终止法对PCR产物测序。取1μl 1∶100稀释PCR C1/C3产物，用C6/C2(C区)或CSP/PC1(前C区)内引物进行第二轮PCR(条件同上)，用异丙醇对PCR产物沉淀纯化。32P末端标记测序引物，按fmol测序试剂盒进行循环测序。电泳、放射自显影后，结果用DNASIS软件处理分析。
表1 HBV前C/C区寡核苷酸引物序列
引物 位置 序列(5′-3′)
C1 (2394-2370)R GGCGGAGGGAGTTCTTCTTCTAGGGGG
C3 (1730-1754) CTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATT
C6 (2348-2330)R ACGGATCCTAAACAACAGTAGTTTCCGG
C2 (1955-1974) TTGCCTTCTGACTTCTTTCC
CSP (1974-1955)R GGAAAGAAGTCAGAAGGCAA
PC1 (1811-1834) ACCATGCAACTTTTCACCTCTGC
R:antisense
结果
经干扰素治疗的6例慢性乙肝患者血清及PBMC中HBV DNA动态观察结果见表2。
表2 动态比较干扰素治疗的6例慢性乙肝患者血清与PBMC中HBV DNA
病例
号 INF(MU) ALT(U/L) HBeAg HBV DNA
血清(PBMC)
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅰ Ⅱ Ⅲ
1 0 1[1] [2] 下一页
上一个医学论文： 慢性乙型肝炎 肝硬变患者血清可溶性gp130的变化
下一个医学论文： 病毒性肝炎患者血清 型胶原水平变化与意义
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 内科论文 >> 正文