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喉乳头状瘤p53过度表达及与HPV的关系 |
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二、方法
1.p53蛋白免疫组化(ABC)染色法及结果判定：鼠抗人p53单抗为北京中山生物技术公司产品，用时按1∶200稀释。ABC试剂盒及二抗、三抗为VECTOR公司产品。标本切片经脱蜡脱水，常规ABC方法染色；DAB显色，甲基绿复染；树脂封片，光镜观察。用已知p53高表达喉癌切片作阳性对照；空白对照为不加一抗，无阳性信号；阴性对照用已知无p53表达的声带息肉切片。
结果判定：每例随机观察10个高倍镜下视野，每个视野计数100个细胞中阳性细胞数(p53细胞核内有棕黄色颗粒)，取其平均值分为四级：Ⅰ：p53＜10%；Ⅱ：p53 10%～30%；Ⅲ：p53 31%～70%；Ⅳ：p53＞70%；核内无棕黄色颗粒。
2.ISH检测HPV及结果判断：基因探针为地高辛标记的HPV 16/18混合型。组织片预处理，二甲苯脱蜡，乙醇梯度下行水化；常规蛋白酶K消化、洗涤、乙醇梯度上行脱水、室温干燥组织切片；滴加探针混合液(含有HPV 16/18探针)，20μl/张，置于50%甲酰胺湿盒中，96℃～98℃ 10分钟进行预杂交；然后将湿盒置于凉水中(约15℃)，10分钟后将湿盒置于38℃湿箱中杂交过夜；次日滴加抗体复合物，伊红染色，二甲苯透明，树脂胶封片。已知HPV 16/18型阳性高表达宫颈癌切片作阳性对照，不滴加探针标本作空白对照。结果判定：HPV感染阳性细胞表现为核内显示紫蓝色颗粒。
结果
一、临床及病理资料分析
共搜集石蜡标本32例，男性14例，女性18例，男女之比为1∶1.3。年龄41～80岁，平均56.4岁。在32例标本中，轻、中、重度非典型增生分别为8、14、10例。据统计，共有4例重度非典型增生病变先后发生了恶变，占12.5%。
二、p53蛋白检测结果
在喉乳头状瘤32例标本中，p53阳性表达率为53.1%(17/32)，Ⅰ、Ⅱ级表达有10例，占58.82%，Ⅲ、Ⅳ级表达有7例，占41.18%。其中轻、中、重度非典型增生p53阳性表达率分别为37.5%(3/8)、50.0%(7/14)、70.0%(7/10)。经统计学检验，重度非典型增生与轻、中度非典型增生有显著性差异(P＜0.05)。
三、HPV感染检测结果
利用原位杂交方法，对32例喉乳头状瘤进行了检测，HPV 16/18的阳性表达率为62.5%(18/32)。
讨论
一、喉乳头状瘤p53过度表达
目前人们对于喉癌的研究已进入分子水平，正常细胞的增殖主要取决于促进生长的原癌基因和抑制生长的肿瘤抑制基因的平衡调节，原癌基因的激活或肿瘤抑制基因的失活都可导致细胞生长的失控，引起正常细胞发生癌变。p53是目前所知的一种重要的细胞生长调控因子，它通过参与细胞周期的调控，对细胞的分裂和增殖发挥负调节作用，与细胞分化及基因的稳定性有关［2］。
p53基因作为抗癌基因，作用方式不同于致癌基因，致癌基因以功能激活的方式致癌，而抗癌基因则以功能失活的方式参与致癌过程。目前至少发现五种机制可使p53蛋白的功能失活：①p53蛋白的一个或两个等位基因缺失和微小的局部缺损。②p53蛋白的编码氨基酸突变。③与人类乳头状瘤病毒E6蛋白的结合而失活。E6蛋白具有结合p53蛋白的特异位点，能和p53形成复合物而使其失活。④与抗癌基因mdm2产物p90蛋白形成复合物而失活。⑤从细胞核中被排至胞浆而失活。
p53基因的功能失活可能是导致肿瘤发生的重要机制之一。在本实验中，喉乳头状瘤p53阳性表达平均为53.1%，其中重度非典型增生病变为70.0%，经统计学检验，轻、中、重度非典型增生有显著性差异(P＜0.05)。在喉乳头状瘤切片中发现，p53阳性染色大多位于基底细胞或基底层细胞上方的细胞中，提示基底细胞可能是早期发生细胞恶变的位置。研究中又发现，重度非典型增生p53的表达强度明显较轻、中度非典型增生病变高，这说明p53基因突变在肿瘤的发生中可能起重要作用。通过对病变特点的研究，可对探索细胞恶变的机理提供有益的帮助。
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