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食管癌组织微环境对树突状细胞的影响 |
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【摘要】 目的: 探讨食管癌组织匀浆上清液体外模拟肿瘤微环境对人树突状细胞(DC)分化发育的影响, 揭示肿瘤免疫逃逸机制, 为DC疫苗的应用提供理论基础。方法: 制备新鲜食管癌及癌旁组织匀浆上清液, ELISA检测其VEGFA含量。密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞, 含rhGMCSF和rhIL4 RPMI1640培养液诱导DC, 第2天在继续诱导DC基础上设食管癌匀浆上清组、 癌旁匀浆上清组、 VEGFA组, 均隔天半量换液, 第4天加入食管癌细胞株EC9706抗原, 第6天加入脂多糖, 第8天收集各组细胞。观察DC形态, 流式细胞术(FCM)检测免疫表型, RTPCR检测CD1a表达, CCK8检测T细胞增殖率及杀伤率。结果: 食管癌组织匀浆上清VEGFA含量[(0.987±0.319) μg/L]明显高于癌旁[(0.152±0.105) μg/L, P<0.05]; 食管癌匀浆上清组细胞形态明显受到抑制, CD86分子阳性率(%)与正常DC相比由69±8降为42±11、 CD1a由56±12降为27±12、 CD11c由21±13降为18±13(P<0.01), CD1a基因几乎无表达, 刺激T细胞增殖率(%)由112.5±7.2降为70.2±3.5(P<0.01), 杀伤率(%)由62.4±0.6 降为46.8±1.6(P<0.01); 癌旁匀浆上清液组、 VEGFA组结果与正常DC组无统计学意义。结论: 食管癌组织匀浆上清液所模拟的微环境对DC的诱导分化及其功能有明显的抑制作用, 在该抑制作用中VEGFA并不起主要作用。
【关键词】 食管肿瘤; 树突状细胞; 匀浆上清; 混合淋巴细胞反应; 细胞毒性T细胞
我国是食管癌高发区, 食管癌死亡率仅次于胃癌居第2位, 食管癌的发生以及防治成为研究的热点。树突状细胞(dendritic cell, DC)是专职抗原提呈细胞, 对于免疫反应的启动、 进展以及免疫耐受的诱导起至关重要的作用[1, 2]。然而在大多数肿瘤患者中, 往往并不能产生DC介导的有效抗原提呈[3]。本研究小组及国内外其他学者应用体外大量扩增DC, 然后用肿瘤抗原冲击后回输患者治疗肿瘤, 取得一定效果[4-6]。研究肿瘤微环境下DC的功能, 可更好地反映宿主的抗瘤免疫状态, 了解其免疫逃逸机制。我们在体外以食管癌组织匀浆上清液模拟肿瘤微环境, 探讨其对DC形态、 表型及功能的影响及VEGFA在其中的作用, 为研究DC介导的肿瘤免疫治疗在食管癌患者中应用提供一定的理论基础。
1 材料和方法
1.1 材料 重组人白细胞介素4(rhIL4)、 重组人白介素2(rhIL2)购自Peprotech公司; 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF)购自厦门特宝生物公司; 淋巴细胞分离液(Ficoll400, 1 077 g/L)和胰蛋白酶购自天津TBD公司; 完全培养基包括: RPMI1640购自美国Gibco公司, 人血清来自健康捐献者自体血清, 青链霉素各10万U/L; FITC标记的CD1a、 CD86、 CD11c、 CD80、 CD83及HLADR单克隆抗体(mAb)购自美国BD公司; RTPCR试剂盒购自TaKaRa公司; TRIzol 购自美国Invitrogen公司; 活细胞计数试剂盒CCK8(cell counting kit8)购自日本同仁化学研究所; 人VEGFA ELISA试剂盒购自Bender MedSystems公司。人食管癌细胞株EC9706由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室馈赠; 外周血来自健康成人献血者, 晨起空腹抽取肘静脉血。
1.2 方法
1.2.1 食管癌标本采集及匀浆制备 取术前无化疗、 放疗史患者手术切除的食管癌组织及距离癌组织5 cm以外的癌旁组织各15例, 病理组织类型均为鳞癌, 无淋巴结转移。标本存放于液氮罐, 用于肿瘤组织匀浆制备。将食管癌及癌旁组织从液氮罐取出, 缓慢复温。称取癌及癌旁组织各200 mg, 浸于青霉素、 链霉素(浓度均为50万U/L)的生理盐水中20 min, 加入1 mL生理盐水, 调整匀浆浓度为200 g/L, 用组织匀浆研磨器缓慢进行组织研磨, 4 000 r/min, 30 min, 离心2次, 弃去下层沉淀, 留取上清液备用, 保存于-20℃冰箱。
1.2.2 双抗体夹心ELISA法检测食管癌及癌旁组织匀浆上清液VEGFA蛋白水平 按人VEGFA ELISA试剂盒说明书要求进行具体操作。VEGFA标 [1] [2] [3] [4] [5] 下一页
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