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运用原位末端标记技术检测大鼠缺氧缺血性脑损伤中III型细胞死亡 |
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(apoptosis) cells increased significantly in the experimental hemisphere 6 hours after HI ［ (21.3±3.5)/10 hpf］, and reached the peak level at 24 hours ［(63.7±3.2)/10 hpf］, when compared with the control ［(7.3±2.3)/10 hpf, P<0.001］. There was no type III cell in the normal brain tissue, while the type III cells could be observed in the experimental hemisphere 24 hours after HI ［(50.6±6.3)/10 hpf］, and reached the peak level at 48 hours ［(75.6±10.2)/10 hpf］, which was higher than the type I cells ［(42.3±4.5)/10 hpf］ at the same time point (P<0.01). The type III cells were mainly located in the necrotic area or around the necrotic area. Conclusions The type III cell death was mainly involved in the delayed cell death following HI injury in addition to the necrosis and apoptosis. The type III cell death was a special type of cell death, which related to apoptosis and necrosis.
【Key words】 Cerebral ischemia; Cerebral anoxia; Cell death; Microscopy; Apoptosis
随着分子生物学技术的发展和检测细胞死亡技术的改进，人们对细胞死亡也有了新的认识。近期的研究表明，在以细胞核DNA裂解和细胞膜通透性增加为判别标准及形态学变化方面，发现了既有凋亡特征又有坏死特征的一类细胞，即晚期凋亡或坏死细胞(III型细胞)。我们在对脑缺氧缺血(HI)新生大鼠模型进行迟发性细胞死亡的研究过程中也观察到了III型细胞。现将其形态学和原位末端标记(ISEL)特征总结如下，并初步探讨其在脑损伤中的意义。
材料和方法
一、实验动物分组
生长条件相同的108只新生大鼠随机分为2组，每组54只。其中一组行颈正中切口后即缝合皮肤(假手术)作为对照组；另一组为缺氧缺血组、即实验组。实验组分别于缺氧结束后0、2、6、12、24、48、72 h及7、14 d断颈处死；对照组于相对应的时间点处死，每个时间点6只。均取右侧(实验组即缺氧缺血侧)大脑半球固定于10%的甲醛溶液中。
二、新生大鼠脑HI模型的制作
参照Rice等［1］的方法，将生后7 d的SD大鼠(购自中国医学科学院上海实验动物中心)取仰卧位，四肢固定于手术板上，颈正中切口，游离右侧颈总动脉并结扎，缝合切口后置于容积为2 L的密闭容器内，该容器置于37℃水浴中。以1～2 L/min的速度输入体积浓度为8％氧气和体积浓度为92％氮气的混合气体，持续2.5 h。
三、ISEL
自丘脑中1/3平面行冠状切片，片厚4 mm，石蜡包埋。切片（4 μm厚）做HE染色、光镜观察后，邻近处的石蜡切片定为标记靶组织。并取对照组相对应组织作为阴性对照。采用原位细胞死亡检测试剂盒(德国宝灵曼公司)，参照陆良勇等［2］的方法进行改进。实验流程为：(1)标记切片常规二甲苯脱蜡，梯度清洗(酒精至自来水)；(2)双蒸水漂洗3次，每次3 min；(3)0.01% Triton X-100(曲通X-100) 处理15 min；(4)双蒸水漂洗3次，每次3 min；(5)3% H2O2阻断内源性过氧化物酶；(6)双蒸水漂洗3次，每次3 min；(7)蛋白酶K 20 μg/ml置37℃水溶槽内30 min；(8)重复步骤2；(上一页 [1] [2] [3] 下一页
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