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雌激素与三苯氧胺对子宫内膜癌细胞bcl |
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一、细胞株与试剂
1. 子宫内膜癌细胞株：子宫内膜癌细胞株雌激素受体（ER）阳性(+) RL-952细胞由上海医科大学妇产科医院提供，其胞浆及胞核ER(+)。
2. 试剂：17-β-雌二醇(E2)和三苯氧胺等为美国Sigma公司产品，RNA抽提试剂盒购自美国Promega公司，bcl-2引物及β-actin引物由上海植物生理研究所研制。
二、方法
1. 细胞培养与RNA抽提：ER(+)RL-952细胞按常规方法培养于RPMI-1640培养液中(含15％小牛血清)，0.25％胰蛋白酶消化传代，分成等量接种入50ml培养瓶中，分为对照组和实验组，接种48小时后，更换培养液。实验组加入17-β-E2或三苯氧胺，使其终浓度分别为10-12、10-10、10-8、10-7mol/L或10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L，对照组及实验组每一剂量接种细胞各3瓶，置于5％二氧化碳培养箱(37℃)培育72小时后，按Promega公司试剂盒要求进行RNA抽提。
2. 逆转录(RT)反应：将待测RNA3μl，寡dT 1 μl，无RNA酶去离子水12μl依次加入eppen-dorf(Ep)管中，70℃反应5分钟，再加入5×逆转录酶缓冲液5μl，dNTP混合物(10mmol/L)2μl，RNA酶抑制剂(40U/ μl) 1μl，M-MLV逆转录酶(200 U/ μl) 1μl，42℃反应1小时，95℃灭活逆转录酶5分钟，0～5℃放置5分钟，-20℃短暂冻存。
3. 聚合酶链反应(PCR)：在Ep管中依次加入10×PCR反应缓冲液5μl， MgCl2(25mmol/L) 3μl ，dNTP混合物(10mmol/L) 1μl，bcl-2(20μmol/L)上、下游引物各1μl，β-actin (20μmol/L)上、下游引物各1μl，Tag聚合酶(5U/μl)0.2μl， cDNA模板2μl，加无菌双蒸水至总反应体积50μl。加1滴石蜡油后移至PCR扩增仪行PCR扩增。95℃ 45秒，65℃ 45秒，72℃ 2分钟，循环35次，72℃ 7分钟，4℃保存。扩增产物在2％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上电泳，以PCR相对分子质量标准为参照物，置紫外灯下，通过密度扫描成像仪进行DNA条带光量子强度分析。
三、统计学处理
本研究数据以平均数±标准差(±s)表示，采用EPI INFO统计软件对数据进行方差分析及相关分析。
结果
一、 RL-952细胞RNA RT-PCR扩增产物
17-β-E2 和三苯氧胺作用后，RL-952细胞RNA RT-PCR扩增产物见图1，2。bcl-2 mRNA的RT-PCR产物为385bp，β-actin为198bp。
M：相对分子质量标准 1：10-12(单位：mol/L，
下同) 2：10-10 3：10-8 4：10-7
图1 17-β-E2作用后RL-952细胞RNA RT－PCR扩增产物
M：相对分子质量标准 1：10-8(单位：mol/L，下同)
2：10-7 3：10-6 4：10-5
图2 三苯氧胺作用后RL-952细胞RNA RT－PCR扩增产物
二、 17-β-E2作用后RL-952细胞中bcl-2 mRNA
17-β-E2作用后，RL-952细胞bcl-2 mRNA有一定的表达，经10-12、10-10、10-8、10-7 mol/L 17-β-E2作用72小时后，其bcl-2与β-actin mRNA的比值分别为6.94±0.03、7.15±0.02、7.47±0.01和8.44±0.01，呈逐渐升高的趋势，与对照组(6.44±0.01)相比,差异有极显著意义(P<0.01)。经相关分析，RL-952细胞bcl-2与β-actin mRNA的比值与17-β-E水平的对数值呈正相关（&g上一页 [1] [2] [3] 下一页
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