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不同转染方法对逆转录病毒转染效率影响的研究 |
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能够最大程度地提高基因转染效率成为众多学者首先要突破的瓶颈。对于转染效率较高的逆转录病毒来说，鉴于病毒自身的生物学特性，不同的加样方法，必然会导致不同的转染效率，本研究采用五种不同的加样方法，探讨最佳的加样转染方法，为提高病毒载体的转染效率提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 材料 载体PLNCX2、pDsRed于Clontech公司生产，pCDNA3.1GFP为本课题组前期构建并保存；Il1Ra基因从正常人脑组织cDNA文库中扩增，扩增模板是购自BD的正常人脑组织cDNA文库质粒；XhoI、HindIII、BamHI限制性内切酶、T4DNA连接酶(TaKaRa)；小鼠肾成纤维细胞系NIH3T3，包装细胞系PT67(Clontech公司)；细胞培养液EMDM/F12(Hyclone)；消化酶、胎牛血清(四季清公司)；G418(Gbico公司)；聚凝胺Polybrene(中山生物工程有限公司)；真核细胞转染试剂LipofectAMINE2000Reagent(Invitrogen公司)；ELISA检测Il1Ra试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)；感受态大肠杆菌、Ⅱ型胶原酶、Protease E、胰酶(大连宝生物有限公司进口分装)；新西兰大白兔购于太原畜牧所。
1.2 方法
1.2.1 逆转录病毒载体PLNCX2IL1RaGFP的构建 载体PLNCX2经XhoI/HindIII双酶切，去磷酸化后，与载体pCDNA3.1GFP(－)经XhoI/HindIII双酶切得到的多克隆位点和GFP基因在T4DNA连接酶的作用下连接，构建成PLNCX2GFP。Il1Ra基因从正常人脑组织cDNA文库中扩增，胶回收，经XhoI/BamHIII双酶切后，与经XhoI/BamHIII双酶切的PLNCX2GFP，在T4DNA连接酶的作用下连接，构建成PLNCX2Il1RaGFP。
1.2.2 逆转录病毒载体的包装及病毒上清滴度的检测［1］ 采用脂质体介导转染法将重组质粒PLNCX2Il1RaGFP转染到生长至80％融合时的包装细胞PT67上(具体操作方法见真核细胞Lipofect AMINE 2000 Reagent转染试剂盒)，用G418筛选培养14 d，待转染细胞形成抗性克隆后挑选出扩增培养、传代、收集各克隆1～4代的病毒上清，过滤后分装－70°冻存。取6孔培养板，每孔加入2×104个NIH3T3细胞株，细胞生长至80％融合时，加入1∶100稀释的阳性克隆病毒液3 mL，培养4 h后换用300 μg/mL的G418筛选液培养4周，计数存活的抗性克隆，根据公式计算病毒上清滴度。
1.2.3 兔膝关节软骨细胞的培养 无菌条件下截取3个月龄新西兰大耳白兔膝关节，洁净工作台内将膝关节打开，利刀将软骨取下，切成约1 mm×1 mm×1 mm的碎块。无菌Hank′s液冲洗，2000 rpm，5 min，弃上清，称重，得知软骨质量。按12 mL/g软骨比例用菌0.4％Pronase(链霉蛋白酶)37℃消化90 min后，600 rpm，5 min，弃上清。按12 mL/g软骨比例用无菌0.025％Ⅱ型胶原酶37℃消化过夜，1200 rpm，10 min，弃上清，加DMEM/F12吹打冲洗，1400 rpm，4 min，弃上清。无菌Hank′s液冲洗，100 pm及40 pm滤膜过滤。细胞记数后(胎盼蓝染色细胞活度大于90％)，按1×105/mL浓度接种于含有盖玻片的六孔板，加入常规原代细胞培养液(DMEM/F12)，10％胎牛血清，置于37℃，5％CO2培养箱内进行原代培养。
1.2.4 逆转录病毒转染上一页 [1] [2] [3] [4] [5] 下一页
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