盾叶薯蓣四倍体株系抗氧化酶活性及有效成分分析

　　1.2 仪器和试剂BECKMAN DU-600分光光度计，水浴锅，微量加样器。酶提取液， pH 7.5的0.05mol/L 的Tris-HCl缓冲液，PBS pH(7.0)，0.1 mmol/L EDTA， 0.1mmol/L H2O2， 0.5 mmol/LASA，丙酮，SOD试剂盒(购于建成生物试剂研究所)。

　　2 方法

　　2.1 SOD，POD，APX活性的测定精密称取盾叶薯蓣试管苗二倍体及其同源四倍体叶片1.0 g，每份材料加5ml预冷的提取缓冲液(pH7.5的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液)及少量石英砂，置于冰浴中研磨后，4℃冷冻离心机6 000 r/min离心10min，上清液即为酶提取液。SOD活性按南京建成生物工程研究所试剂盒说明书操作。POD总活力按文献[2]的方法进行，酶的比活力用ΔOD470/ (mg·min)(protein)表示。APX活性参照文献[2]的方法，酶活单位定义为每小时氧化1μmol ASA的酶量为一个酶活单位。

　　2.2 盾叶薯蓣试管苗薯蓣皂苷元含量分析

　　2.2.1 样品制作盾叶薯蓣试管苗在MS/2+IAA 0.2 mg/L+NAA0.2 mg/L培养基上诱导生根，待苗长至30～35d左右，洗净根上的培养基，将根剪掉，在60℃下烘干，粉碎，过60目筛，供含量分析用。

　　2.2.2 薯蓣皂苷元的测定供试品溶液制备[3，4]：精密称取盾叶薯蓣粉末0.7～1.0 g，置于三角瓶中，加2.0 mol/L的硫酸50 ml，在100℃水浴锅中水解4 h，放冷过滤，药渣用蒸馏水洗至中性，60℃干燥后，用石油醚(60～90℃)50 ml在90℃水浴中索市氏提取5h，提取液回收至干后用无水乙醇溶解，过滤至5ml的容量瓶中，用无水乙醇定容待测定。

　　对照品溶液制备：准确称取薯蓣皂苷元标样0.001 g，置2 ml容量瓶中，用无水乙醇溶解，稀释至刻度，得0.5 μg/μl的标准溶液备用。

　　色谱条件选择[5，6]：仪器：Agilent 1100 Series。分析条件：Microsorb-MV100 C18 (5μm，4.6 mm×250 mm )。无水甲醇为流动相，进样量20 μl，流速0.5 ml/min, 检测波长203 nm, 柱温为室温。样品中薯蓣皂苷元与其它成分达到良好分离(见图1)。

　　样品含量测定：以上述色谱条件对盾叶薯蓣中薯蓣皂苷元含量进行分析，并计算其含量。

　　3 结果

　　3.1 四倍体与二倍体SOD，POD，APX活性比较

　　盾叶薯蓣二倍体与其同源四倍体各抗氧化酶的比较结果见表1。由表1可以看出，盾叶薯蓣四倍体株系APX活性基本上与二倍体相近或略大，其中有12个株系比二倍体高;14个四倍体株系POD活性均高于二倍体对照株系，平均高出23.4%，POD活性最高的株系G2比对照高出59%。16个四倍体株系SOD活性均高于二倍体对照。平均高出48.1%，活性最高的株系10-10比对照高出127%。表1 四倍体与二倍体SOD，POD，APX活性比较(略)

　　3.2 盾叶薯蓣试管苗同源四倍体株系薯蓣皂苷元含量分析

　　对诱导获得的19个四倍体株系试管苗的薯蓣皂苷元含量进行了初步分析。结果见表2，图2～4。测定结果显示：19个盾叶薯蓣四倍体株系中，有10个株系的薯蓣皂苷元含量高于二倍体，平均比对照株系高出30.8%。其中10-1、12-4、y9、3-1、y24、11-10，分别比对照株系高出75%，50%，50%，33%，25%，25%。表2 盾叶薯蓣四倍体株系薯蓣皂苷元含量(略)

　　4 讨论

　　目前，寻找强抗逆性植物，抵御活性氧对植物细胞的损伤越来越受到人们的重视。现已有通过基因扩增，使SOD过度表达，产生较强抗逆性的转基因植物。但由于SOD降解超氧阴离子产生的H2O2同样也是一种活性氧，对植物细胞也有很大伤害，因此单一通过转一种基因并不能达到彻底清除活性氧的目的。SOD在需氧原核生物和真核生物中广泛存在，是活性氧清除系统中第一个发挥作用的抗氧化酶，也是植物体内氧代谢的关键酶，在保护细胞免受氧化损伤过程中具有十分重要的作用。POD可清除植物体内的H2O2，从而使需氧生物体免受H2O2的毒害[7]，APX被认为叶绿体中清除H2O2的关键酶。试验获得的大部分盾叶薯蓣四倍体株系SOD，POD和APX比活力均高于二倍体，说明这些株系将具有比对照株系更高的抗逆性或抵抗自然灾

上一页  [1] [2] [3] 下一页