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血管紧张素原基因M235T分子变异与2型糖尿病肾病的关系 |
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tes mellitus Polymerase chain reaction
糖尿病肾病的发生与血流动力学异常有关。肾素-血管紧张素(R-A)系统是体内重要的血压调控系统，与糖尿病大小血管并发症的发病有关［1］，近年来R-A系统基因研究进一步证实该观点［2］。文献报道血管紧张素原(angioten-sinogen,AGT)基因M235T分子变异与欧洲白种人1型糖尿病肾病有关联，与2型糖尿病肾病的关系报道甚少［3］。人AGT基因位于染色体1q42-43［4］，长12kb，系单拷贝基因，由5个外显子和4个内含子组成，其中外显子2内存在一种分子变异，即核苷酸704处T被C代替后，编码产物第235号氨基酸由蛋氨酸变异为苏氨酸，我们用多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法及限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)技术检测出该变异，并探讨了其与2型糖尿病肾病的关系。
1 材料与方法
1.1 研究对象 糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)96例(DN组)，年龄58±13岁，男55例，女41例，病史9～26年，按WHO标准及糖尿病肾病诊断标准即半年内3次尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate, UAER)＞20μg/min(放免法)确诊为2型糖尿病肾病患者，其中33例为糖尿病肾病Ⅲ期，59例Ⅳ期，4例Ⅴ期［5］。按有无高血压又分为DN合并高血压组(DN-H组)67例，无高血压的DN单一组(DN-S组)29例。无肾病并发症的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,DM)84例(DM组)，年龄58±13，男45例，女39例，病史9～25年。诊断标准为UAER＜20μg/min。按有无合并高血压又分为DM合并高血压组(DM-H组)34例，无高血压的DM单一组(DM-S)50例。正常对照组98名，年龄57±11岁，男56名，女42名，经检查均排除糖尿病、高血压、冠心病及肾病，且均无糖尿病家族史。
1.2 实验方法 多聚酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测AGT基因的基因型。用标准酚/氯仿法由周围血白细胞内提取基因组DNA，以PCR扩增对象基因组DNA中AGT基因第2外显子M235T分子变异。PCR反应引物为正向5′-CCGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTCT-3′；反向5′-CAGGGTGCTGTCCACACTGGACCCC-3′(AC为非配对碱基，由Cybersyn公司合成)，如为T235等位基因纯合型(TT型)，因外显子2第235号密码子ATG变为ACG，产生了一个适合Asp Ⅰ酶切位点(GACN↓NNGTC)。在25μl的反应体系中包括各10pmol的引物，5μl的10×buffer，0.5mmol/L dNTP1.2μl，1U Taq酶，模板DNA0.1 μg在PCR自动循环仪(GeneAmp PCR system 2400,PE公司)上按以下条件进行循环反应［3］：94℃预变性180秒后进入循环，反应条件是94℃变性60秒；63℃退火80秒，72℃延伸60秒；完成35个循环后，在72℃再延伸5分钟，取扩增产物10μl，加含12U的Asp Ⅰ(Boehringer Mannheim公司)限制性内切酶1.2 μl，10×buffer 2.0 μl，去离子水6.8 μl，37℃水浴酶切反应3小时，取反应产物10 μl，加载样缓冲液1 μl，在含EB的3%琼脂糖凝胶中进行电泳分析。
1.3 统计方法 计算各组基因型频率及等位基因频率，经计算确认其符合Hardy-Weinberg平衡，组间频率比较用χ2检验，组间均数比较采用t检验及q检验，用Logistic回归进行风险因素独立性分析，数据用SPSS软件进行处理。
2 结果
2.1 DN组、DM组与对照组AGT M235T基因型及等位基因型频率比较 用PCR-RFLP方法检测的结果见图1。如为235M等位基因纯合型(MM型)，可扩增出1条165bp的片段，如为T235等位基因纯合型(TT型)，因外显子2第235号密码子ATG变为ACG，产生了一个适合被Asp Ⅰ酶切的位点，因此酶切后可产生141bp和24bp两个片段；AGT基因M235T杂合型(MT型)则上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] 下一页
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