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肺癌CDKN2/p16基因纯合缺失的研究 |
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，存放于液氮中。89例肺癌中，男68例，女21例，男女比例3.2∶1，年龄35～84岁，平均年龄59岁。按WHO标准分类，鳞癌39例，腺癌31例，腺鳞癌2例，小细胞癌17例。高分化29例，中低分化60例。按国际抗癌联盟标准进行临床病理分期，Ⅰ期18例，Ⅱ期23例，Ⅲ期37例，Ⅳ期11例。对69例所取淋巴结进行病理诊断，37例有淋巴结转移，32例无转移。
1.2 标本处理 按两种方法进行标本处理。(1)常规方法：参照文献［6］进行基因组DNA提取。取液氮保存的标本，在未解冻时迅速用眼科剪剪碎，加入200μl含1%SDS-蛋白酶K的50mmol/L pH8.0 Tris-HCl溶液，42℃消化过夜，等体积酚／氯仿／异戊醇(25∶24∶1)抽提，预冷无水乙醇沉淀，70%乙醇漂洗，TE溶解，作为PCR扩增的模板；(2)改良方法：所取肿瘤部位标本，经10%中性福尔马林固定后，进行低温石蜡包埋。先切一片厚5μm进行HE染色，显微镜下确定癌巢区(癌细胞富集区)，区内间质细胞含量应少于10%，做好标记。再进行连续切片10片，厚15μm，在HE标记区内的相应范围内，以锋利刀片刮取组织，放入Eppendorf管内，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，按上述常规方法进行DNA提取。两种方法提取的大分子量基因组DNA，经紫外分光光度计检测，A260/A280＞1.8(A为吸光度，旧称光密度OD)。
1.3 引物设计 根据CDKN2/p16基因序列并参考文献［7-9］，在E1、E2两侧各设计1对扩增引物。exon1 P1:5′-GAAGAAAGAGGAGGGGCTG-3′，P2：5′-GCGCTACCTGATTCCAATTC-3′，扩增产物长度340bp。exon2 P1：5′-GGCTCTACACAAGCTT-CCTT-3′，P2：5′-TGAGCTTTGGAAGCTCTCAG-3′，扩增产物长度427bp。实验以β肌动蛋白引物作为内对照，引物序列β-actin P1:5′-GGCGGCACCACC-ATGTACCCT-3′，P2：5′-AGGGGCCGGACTCGTC-ATACT-3′，扩增产物长度312bp。上述引物均由中国科学院微生物研究所合成。
1.4 基因扩增 以提取的基因组DNA为模板，在同一反应管中同时扩增基因组中的CDKN2/p16基因E1、E2和β-actin基因。PCR试剂盒购自第四军医大学全军基因诊断技术应用研究所。PCR反应总体积为20μl，在DNA扩增仪(Perkin Elmer 2400)上进行如下反应：95℃20秒，58℃10秒，72℃30秒，35个循环后，72℃延长5分钟结束反应。取10μl PCR反应产物，在1.5%琼脂糖凝胶上电泳分析。
2 结果
2.1 肺癌CDKN2/p16基因缺失检出率 89例在肺癌边缘部位所取的正常肺组织，均未发现有CDKN2/p16基因E1、E2缺失。在89例肺癌组织中，用常规取材的PCR方法对E1、E2缺失的检出率分别为9.0%(8/89)和11.2%(10/89)，其中有6例E1、E2同时缺失，E1或(和)E2总缺失率为13.5%(12/89)；用改良取材的PCR方法对E1、E2缺失的检出率分别为19.1%(17/89)和22.5%(20/89)，E1或(和)E2总缺失率为25.8%(23/89)，有14例E1、E2同时缺失(图1)。改良方法对E1或(和)E2缺失的总检出率较常规方法提高了12.3%，两种方法有显著性差异，P＜0.05。
2.2 肺癌CDKN2/p16基因 E1、E2缺失与肺癌患者的临床因素以及病理特征之间的关系见表1。
表1 CDKN2/p16基因缺失与肺癌临床病理的关系(改良方法)
Tab 1 Correlation between CDKN2/p16 gene deletion and lung cancer
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