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抗HBsAg人IgG表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达 |
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临床上有防治乙肝的应用前景，如用于预防新生儿的乙肝病毒的垂直传播和制备治 疗性乙肝疫苗［1，2］。但人单克隆抗体的制备一直较为困难，噬菌体抗体库技术的 出现使多年来人源性抗体制备的难题得到了解决。通过这条新途径，各种人源性抗体不断出 现，已显示出其作为体内诊疗制剂应用与发展的诱人前景。我们在以前的工作中曾用噬菌体 抗体库技术从接种过乙肝疫苗的个体克隆到两株不同的抗HBsAg人Fab段基因［3，4］ 。从抗体库中获得的抗体可变区基因可在大肠杆菌表达的小分子抗体，在某些情况下，尤其 用于体内治疗，需要Fc段的生物学效应功能，因此需制备完整的抗体分子，本研究试图将其中一株抗HBsAg Fab转换成真核表达的完整的人IgG1，并通过扩增的方法提高人IgG在CHO细 胞中的表达量。为其进一步应用打下基础。现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 质粒和细胞株 抗HBsAg人Fab基因的载体质粒p3HB2-1由本室构建［4］，大 肠杆菌菌株XL1-Blue由本室保存。可同时表达人轻、重链的真核表达载体(含DHFR基因)pDH L 由中科院微生物所阎锡蕴教授惠赠。人κ链前导序列的载体质粒pUCL由本室构建。CHO(DHFR -)细胞系由军事医学科学院沈倍奋教授惠赠。
1.2 寡核苷酸引物 前导序列的设计与合成，用于扩增VH和Vκ以及将前 导序列与VH、Vκ拼接的引物LEK、HK3、LEH、HG3、SIG、PDVK3及PDVH3，见文献［5］。
1.3 真核表达载体的构建 分别用LEK+HK3和LEH+HG3从原核表达载体上扩 增与前导序列3 ’端互补的κ链和Fd段，再通过重叠PCR，以所获κ段或Fd段与含前导序列的质粒pUCL互为 引 物和模板PCR扩增7圈，补加前导序列5’端引物SIG和Vκ3’端引物PDVK3或VH3’端引物PDVH 3，继续扩增30圈，获得400 bp左右的带前导序列的Vκ和VH基因。经琼脂糖电泳分离、纯化 、电洗脱回收后分别将Vκ和VH重组到真核表达体pDHL的相应部位。得表达载体pDHLHB2。
1.4 CHO细胞的转染和克隆化培养 取表达载体DNA 0.4 μg，加到含有4 μ1Plus Reagent 的25 μ1无血清IMDM培养基中，室温置15 min；另取LipofectimAMINE Reagent 1 μ1加入2 5 μ1无血清IMDM中。以上两种液体混合后室温置15 min，取混合液逐滴加入1×105CHO 细胞 /200 μ1无血清IMDM培养基中。37C培养3 h后，补加含10%小牛血清的非选择培养液至 1 m1。次日吸出细胞上清，换入1 m1非选择性培养基，48 h后取上清检测IgG的瞬时表达。 同 时用有限稀释 法在96孔板上进行转染细胞的克隆化培养，加入选择性培养基(不含次黄嘌呤 和胸腺嘧啶的IMDM培养液)。10 d后开始检测单克隆，挑出阳性孔细胞继续进行亚克隆化培 养，直至所有亚克隆细胞100%为阳性克隆，稳定表达IgG的单克隆细胞。
1.5 氨甲喋呤(MTX)对IgG表达的扩增 挑选表达抗HBsAg人IgG的单克隆 转染细胞系，在 选择培养液中加入10-7mol/L MTX，培养细胞2 w后做亚克隆培养，挑选出表达量提 高的 单克隆细胞，继续用MTX加压，浓度至10-6 mol/L，2 w后同上处理。再将MTX增加到 10 -5 mol/L。检测加压后生长的亚克隆细胞培养上清中的人IgG表达量和与抗原的结合活 性。
1.6 金属离子锌和镉对MTI启动子的激活 在转染细胞的培养液中加入 不同浓 度硫酸锌(0.78～200 μm)和硫酸镉(0.007～2 μm)，1 w后，检测细胞培养上清中 IgG的表达。
1.7 ELISA
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