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肾综合征出血热病人恢复期血清对汉滩病毒感染体外培养神经元的保护作用 |
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材料与方法
1.材料
(1) 仪器：CO2孵箱(Nuaire日本)，超净台(国产)，IMT-2相差显微镜(Olympus日本)，解剖显微镜(国产)，ELISA-MR4000(Dynatech日本)，显微解剖器械(Sigma,美国)，96孔塑料培养板(Nunc,丹麦)。
(2)细胞培养用液：胎牛血清(Sigma,美国)，DMEM液(Gibco,美国)，马血清(Sigma,美国)，阿糖胞苷(Sigma,美国)，鼠尾胶元(使用大鼠鼠尾腱，自制)，D液(解剖用，自制)，0.125%胰酶(自配)。
(3)试剂：MTT(Sigma,美国)，DMSO(国产)，HTNV(本室保存)。
(4)实验动物：孕16～19天〔2〕昆明种小鼠(第四军医大学实验动物中心提供)。
2.方法
(1)细胞培养：参照Ransom等〔3〕细胞培养方法并加以改良。塑料培养板每孔以鼠尾胶元涂布后吹干；孕16～19天昆明种小鼠脱颈处死后，无菌条件下取出双侧子宫置冰盒上；解剖显微镜下剥离胎鼠大脑皮层，置D液中，仔细剥去血膜，吸去D液后，剪碎脑皮质，加入0.125%胰酶消化液消化30分钟(37℃)吸去消化液，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液；室温下终止消化10分钟；DMEM培养液洗一次，用吸管在含20%胎牛血清的DMEM培养液中将消化后的组织块吹打成细胞悬液；将细胞浓度调至105/ml,每孔0.2ml接种于塑料培养板中，5%CO2孵箱，37℃中培养。接种24～36小时后，每孔加入1μl阿糖胞苷(Ara-C)，终浓度为10μmol/L，抑制胶质细胞以及成纤维细胞等非神经元细胞过度增殖；作用24小时后，更换新鲜的完全培养液(含DMEM 90%，Hos 10%)，以后隔二日换液。
(2)HFRS病人恢复期血清及阴性对照组血清来源；临床确诊为HFRS病人的恢复期血清经IFA测定特异性IgG抗体滴度达1∶2 560以上，使用稀释度为1∶20〔4〕，血清置-20℃冻存。阴性对照组血清采自健康成人，血清HRFS特异性IgG抗体检查阴性，使用稀释度1∶20，血清置-20℃冻存。
(3)分组：随机将培养3天的神经元细胞分成A、B、C、D四组，每组各16孔，除D组外，每孔均加入HTNV(A9)上清液(1∶100)，每孔20μl。
A组：恢复期血清保护组：按加入恢复期血清量的不同，再分为20，30，40，50μl 4个小组。
B组：阴性血清对照组：按加入健康人血清量的不同，再分为20，30，40，50μl 4个小组。每孔用培养液补足至总容量为200μl，4小时后换新鲜培养液，继续培养2天。
C组：HTNV感染对照组：加入HTNV(A9)作用4小时后换新鲜培养液，继续培养2天。
D组：正常细胞对照组。
(4)呈色：用改良的Mosmann方法〔5〕将培养5天的神经元，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl,37℃继续孵育4小时，终止培养，吸弃孔内培养液，每孔加入100μl DMSO,室温下静置10分钟。
(5)检测分析：将96孔板放在Dynatech MR 4000型ELISA读数仪上测各孔A570、A630的吸光度值，将A570值减去A630值，即为测定A值的结果。检测波长570nm,参考波长630nm。
(6) 统计分析：所得数据用方差分析进行检验。
结 果
1.神经元一般形态：D组对照神经元种植24小时，镜下观察细胞已经贴壁，有团聚现象，部分神经元有小突起(图1)。加入阿糖胞苷作用24小时后，神经元背景清晰，细胞已伸出突起，成纤维细胞减少(图2)。培养5天的神经元间网络形成，易辨认区别。HTNV感染对照组(C组)经培养2日后，神经元部分漂浮，网络减少，且有中断现象，细胞胞体不清且较小。加入不同量(20μl至50μl)恢复期血清保护组(A组)中各小组的神经元外观形态均无大变化，神经元胞体清晰，神经元间网络形成。加入不同量(20μl至50μl)健康人血清对照组(B组)中各小组的神经元镜下观察细胞稀少，神经元胞体形态不一，神经元网络形成不良(图2，3，4)。
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