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染色体微切割 微分离 微克隆技术及其研究进展 |
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定片段的PCR扩增进行鉴定。
1.4.1 Southern杂交分析 Southern杂交时可用一定的标记物标记基因组DNA，与建立的染色体DNA文库进行杂交，或标记建立的DNA文库中插入片段，用其作为探针与基因组DNA进行杂交。其目的是初步鉴定该文库中插入片段的来源。但即使有杂交信号，也存在以下几种可能性：a:来自于目的染色体；b:与目的染色体DNA序列同源，故需要进一步验证。
1.4.2 原位杂交分析 用得到的染色体DNA文库中插入片段作探针进行原位杂交。其目的是检测：①插入片段是否源自目的染色体；②鉴别该染色体特有的克隆；③鉴别与其他染色体共有的克隆。所用探针可用放射性同位素和非放射性标记物如地高辛、生物素等进行标记。最初，放射性同位素是主要的标记物，现在主要采用荧光原位杂交技术(fluerescent In Situ hybridization，FISH)进行检测［6］。
1.4.3 PCR扩增方法 PCR扩增时所用DNA模板可以是微分离的染色体DNA［7］，也可以是染色体DNA文库中的插入片段。只要该染色体某一基因(TypeI)DNA两侧序列可知，就可利用PCR鉴别该染色体的特异性。
2 方法的改进
2.1 染色体的分离
最初采用玻璃微针在倒置显微镜下分离目的染色体或其特定区域。1972年Fukui等开发出显微激光切割法［8］。该方法主要特点：①用激光切割染色体以分离染色体特定区域［9］；②利用激光产生的高温“烧掉”目的染色体周围的染色体，然后分离目的染色体［33］。Ponelies等采用激光微切割果蝇多线染色体后进行微克隆，并测出端粒DNA序列［10］。王兰岚等应用激光切割小冰麦异附加系花粉母细胞染色体。其目的是探索该技术应用于农作物染色体工程和基因定位的可能性［11］。
另一种方法是用流式细胞仪分选特定染色体。其原理是利用与染色体DNA特异结合的荧光染料hoechst33258和色霉素A3对染色体DNA染色后，根据染色体碱基组成和含量分选染色体［12，13，14］。该方法可在短时间内分离大量的同一染色体。但也存在缺陷：①形态相似的染色体难以分开；②不能构建染色体区域特异的DNA文库。尽管用激光微束切割和流式细胞分选仪分离染色体更方便并可自动控制，但由于仪器昂贵，这两种方法并没有得到广泛普及。许多学者更偏向于用玻璃微针切割和分离染色体［15，16，17］。
2.2 染色体DNA的微克隆
分离得到的染色体DNA进行体外扩增以增加模板量。最初采用酶切直接克隆法［1，18］。该方法的优点是克隆片段相对较大。缺点是技术复杂、操作精细，为满足微克隆对DNA模板量的要求需要分离100～200条同一染色体片段。PCR技术的出现及其广泛应用，使染色体微切割、分离及克隆技术得到很大的发展。
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