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大鼠细动脉平滑肌细胞内酸中毒对ATP敏感钾通道的影响 |
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的无钙HPSS液(HPSS mmol/L:NaCl 130, KCl 5,MgCl2 1.2, CaCl2 1.5, hepes 10, glucose 10, pH 7.2)灌注肠系膜血管床10 min以去除血管内皮。分离肠系膜2～3级细动脉(直径＜120 μm)，在36℃下，用含链酶蛋白酶E 1～1.5 mg/mL的HPSS液消化20 min左右。取出血管用HPSS液彻底清洗残余酶，用针头将血管分离成丝状，再用吸管反复吹打使细胞游离。将含细胞液体吸入离心管静置竖立约2 min，让未散开的大块组织下沉，取上部细胞悬液置于4℃冰箱备用。经透射电镜超微结构观察及培养分离细胞用抗平滑肌肌动蛋白单克隆抗体鉴定为平滑肌细胞。
(二)单离子通道记录和分析：采用膜片钳技术的内面向外式。充灌电极和浴槽液同为高钾溶液，此时细胞膜静息电位接近0 mV，便于K+通道的识别和结果分析。电极液为(mmol/L):KCl 140, MgCl2 1, CaCl2 2, CdCl2 0.3, TTX 0.001, hepes10, pH7.2。浴槽液为细胞内膜面所接触的液体，相当于细胞内液(mmol/L):KCl 120, KOH 20, EGTA 5, MgCl2 1, TTX 0.001, hepes 10, 根据需要加或不加K2-ATP,通过改变KOH浓度使浴槽液pH调整到所需的7.2， 7.0， 6.8。
玻璃微电极用微电极拉制器(PE-7，Narishige)常规两步法拉制，尖端直径为0.5～1.5 μm，充灌液体后电阻约为8～16 MΩ。记录电流经膜片钳放大器(CEZ-2300， KOHDEN)放大，探头反馈电阻10 GΩ。低通滤波频率为3 kHz。计算机Fetchex程序采样。
用pCLAMP分析程序Fetchan进行开关事件的测量，设定通道开、关事件时间分辨率为200 μs，测量幅度的时间分辨率为500 μs，测量结果用pSTAT程序进行统计分析。
所有统计学处理均用Microsoft Excel进行，数据用±s，各参数比较用Student's t检验，以P＜0.05为差异显著性界限。
结 果
(一)KATP通道的鉴定：由于电极液中加有TTX阻断了Na+通道，使用CdCl2阻断了Ca2+通道，在0 mV, -20 mV,-40 mV钳制电压下，电流幅度分别为0，-3.06，-6.26 pA，对二者用回归分析，发现通道反转电位在0 mV附近，因此记录的电流是钾通道电流。向浴槽液中加入ATP能阻断通道电流，这是KATP通道的特点，证明所记录的通道为KATP通道。
(二)浴槽液中无ATP时，H+对细动脉平滑肌KATP通道的影响：在细胞内面向外式记录时，电流幅度在同一钳制电压下基本相同，其幅度分布直方图呈对称的单峰状，并能很好地进行正态拟合。实验记录了-20 mV和-40 mV钳制电压下，pH分别为7.2，7.0，6.8时单通道电流幅度。发现随着pH降低，电流幅度有降低趋势，pH越低，相同钳制电压下电流幅度越小(表1)。
表1 平滑肌细胞内缺乏ATP时细胞内H+对KATP
通道电流幅度(pA)的影响
Tab 1 Effect of intracellular H+ on amplitude (pA) of KATP channel
in arteriolar smooth muscle cells in the absence of ATP
Voltage Amplitude
(pH)7.2 7.0 6.8
-20mv 3.06±0.40 2.61±0.46** 2.59±0.71
(n) 8 8 5
-40mV 6.27±1.56 5.77±1.53 5.45±0.31
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