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垂直传播中乙型肝炎病毒S区变异株检出及其流行病学意义 |
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1995年3月至1996年3月在湖南某县以HBsAg筛检前来终止妊娠的孕妇及其丈夫，选择4名女性HBV携带者与6名男性携带者及HBV DNA阳性的子宫内受染胎儿为研究对象。男、女性携带者以ELISA检测常规五项HBV血清学标志进一步确定。均无既往肝炎史，谷丙转氨酶正常，无乙肝疫苗注射史，其配偶ELISA检测HBV血清学标志及PCR检测HBV DNA均阴性。年龄均在23～35岁之间。取终止妊娠6～8月引产胎儿，胎儿血在产出当时从心脏采取，分离血清保存于－20℃。同时分离白细胞，无菌条件下取肝脏。以PCR检测胎儿血清、白细胞、肝脏HBV DNA，任何一项阳性则判定为子宫内感染。凡是胎儿与母亲均阳性而父亲阴性者为一组，胎儿与父亲均阳性而母亲阴性者为一组纳入本研究。各种标本在住院期间收集。另外选择5对无任何HBV标志的夫妇及胎儿为对照。
二、检测方法：
1.ELISA检测HBV五项血清学标志包括HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc。
2.各种标本的处理及DNA的抽提方法见文献［4］。
3.PCR技术检测HBV DNA，引物取自S区(表1)。外引物为S1R、BS1，扩增片段为787bp。内引物为S3、BS3，扩增片段为261bp。第一轮PCR产物1∶50稀释作为第二轮PCR的模板，每轮PCR均设阳、阴性对照与空白对照。常规PCR方法参考文献［4］。阳性标本以斑点杂交法确认，操作按说明书。
表1 PCR引物序列
引物 位置 序 列
S1R 842～822 5’TTAGGGTTTAAATGTATACCC3’
BS1 56～76 CCTGCTGGTGGCTCCAGTTCC
S3 427～448 CATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG
BS3 687～668 GGCACTAGTAAACTGAGCCA
4.取第二轮PCR产物，以等体积醋酸胺与2倍体积异丙醇纯化，用Fmol DNA cycle sequecing system以双脱氧链末端终止法测序。读片结果输入计算机用DNASIS软件处理。结果与发表的序列(genebank)比较。
三、试剂：引物合成于中科院上海细胞所。Taq酶、Mark等购自华美试剂公司。Fmol DNA cycle sequencing system购自Promega公司。γ-32P-ATP购自北京亚辉公司。地高辛标记的HBV DNA探针购自上海医科大学。
结果
4名女性HBV携带者HBsAg、HBeAg阳性，血清与白细胞HBV DNA亦阳性。4例胎儿血清、白细胞、肝脏HBV DNA均阳性。仅1例血清HBsAg阳性。6名男性携带者中4名HBsAg、HBeAg阳性，2名HBsAg、抗-HBe阳性。6名携带者血清、5名携带者白细胞、5名携带者精液、精子HBV DNA阳性。胎儿6例血清、肝脏，5例白细胞HBV DNA阳性，仅1例血清HBsAg、HBeAg阳性。以巢式PCR检测HBV DNA 62份标本，阳性58份，其中63.8%(37/58)是第二轮PCR检测时出现阳性结果。尤其是精子标本在第一轮均阴性。5例对照胎儿与父母各种标本均无HBV感染标志。
以PCR产物直接序列分析，测定10名携带者与10例胎儿的HBV S基因第451～660位核苷酸(从HBV的EcoR1酶切点计算)。4例胎儿及母亲、6例胎儿及父亲的HBV S基因第451～660位核苷酸同源性均在98%～100%。根据HBsAg第122位与160位氨基酸是赖氨酸或精氨酸确定HBsAg d、y与w、r亚型。4例胎儿及母亲、6例胎儿及父亲在122、160位均为AAA(赖氨酸)，故均为adw型，可能与研究对象来自同一地区有关。从S基因的检测结果看，4对母子与6对父子共同变异的有5个位点，即493、499、508、529、530位，仅第3对母子与第3对父子在530位由A变为G致使第126位氨基酸由苏氨酸变为丙氨酸。其它均为无表型变异。4对母子中2对，6对父子中4对胎儿的此段序列与父、母亲完全一致。另外2对母子、2对父子在个别碱基有差异，第544、546位碱基父、母亲为A、C，胎儿为C、A。其中2对581、586位碱基父、母亲为A、C，胎儿为T、T。其中1对父子491、499位父亲为T、T，胎儿为A、A。上述变异位点中491、494位的变异使胎儿S区第113、114位氨基酸由丝氨酸变为苏氨酸，546的变异使S区第131位氨基酸由苏氨酸变为天冬酰胺。581位的上一页 [1] [2] [3] 下一页
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