百日咳毒素S1亚单位的分子修饰及在重组杆状病毒中的表达

　　百日咳是一种严重的呼吸系统疾病，有时伴有神经症状。其病原菌——百日咳杆菌能产生十多种毒性因子，其中的百日咳毒素(PT)是一种外毒素，由5种不同亚单位组成A-B结构。A结构即S1亚单位，分子量为26 kD，具有鸟嘌呤结合蛋白(G蛋白)特异性核糖转移酶活性，而G蛋白与腺苷酸环化酶抑制信号的传导有关。由于PT可与多种细胞结合，从而抑制G蛋白介导的多种信号传递系统，产生细胞毒性作用。传统百日咳疫苗的毒副作用与S1亚单位的酶活性有关。近年研究均致力于S1亚单位的遗传学脱毒。Burnette等应用定点突变术构建了一种S1变异子(Arg 9→Lys，或R9→K)［1］，其酶活性降至阴性对照水平，但仍保持其保护性抗原决定簇，这为安全有效的新型百日咳疫苗的研制打下了基础。重组杆状病毒(rBV)载体以其高效、真实地表达外源基因的特性而被广泛应用。本研究中，我们对天然及变异S1亚单位编码基因进行了一系列分子修饰，并用rBV载体系统高水平地表达了这些重组S1亚单位，为其免疫学特性评价奠定了基础。

1　材料与方法
1.1　菌株、病毒及细胞系　大肠杆菌DH5α株用于质粒扩增；野生型杆状病毒Autographa california核多角体病毒株(wtAcNPV)用于同源重组；昆虫(Spodoptera frugiperda)卵细胞系Sf9和Sf21用于rBV增殖和蛋白质表达。
1.2　主要试剂　工具酶及DNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim)；杆状病毒转移载体质粒pVL1392和pVL1393(Invitrogen)；PT及S1亚单位(List Biological Laboratory公司)；兔抗PT高免血清的制备见文献［2］；抗S1亚单位单克隆抗体1B7由Sato博士惠赠［3］；碱性磷酸酶标记的多克隆羊抗兔或鼠IgG抗体(Zymed　Laboratory公司)；蛋白定量试剂盒(Sigma)。
1.3　S1亚单位编码基因的修饰　在编码天然S1亚单位DNA片段的克隆和定点突变的基础上［1，2］，使用pUC18及pUC19载体构建了遗传学修饰的S1 DNA克隆(图1)。流感病毒血凝素(HA)信号序列(77 bp)和嵌膜序列为人工合成［4，5］。应用双脱氧序列分析技术确证这些S1 DNA片段序列的正确性。
 

图1　S1亚单位编码基因的分子修饰
Fig.1　Modification of S1 DNA molecules

1.4　杆状病毒转移载体的构建　上述8种pUC重组质粒(pUCS1)分离相应的S1 DNA片段，分将其亚克隆到杆状病毒转移载体pVL1392或pVL1393(视克隆方向而定)中。原位杂交和酶切分析筛选和鉴定重组pVL质粒(pVLS1)。
1.5　DNA转染及rBV纯化　采用线性AcNPV转染技术(Invitrogen公司)。3轮蚀斑筛选和纯化后将斑点杂交和免疫斑点试验双阳性的病毒蚀斑克隆在Sf9细胞中增殖。
1.6　原位及斑点杂交　采用随机引物标记技术将S1/2 DNA片段经32P标记后用作探针，检测重组菌落的rBVs中的S1 DNA。菌落的原位杂交按常规方法进行。斑点杂交时先将rBV感染的细胞用1 mol/L NaOH裂解后加到硝酸纤维素膜上，进行杂交。
1.7　SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、免疫印迹(Western blot)和免疫斑点(Immunoblot)试验
1.7.1　SDS-PAGE　感染样品(Sf21细胞、昆虫幼虫或血淋巴)经SDS-PAGE分离，分离胶浓度为12%。以纯化的PT作阳性对照，wtAcNPV感染的昆虫幼虫或表达牛水疱性口炎病毒核蛋白(VSV-N)的rBV感染的Sf21细胞用作阴性对照［6］。

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