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小鼠雄性生殖细胞生后发育中的程序性死亡 |
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BS稀释)室温孵育1 h。(9)0.075% Brij(洗涤剂)-PBS洗4次，各10 min。(10)用含氯化钴和硫酸镍铵的DAB-过氧化氢室温显色6 min。
阴性对照在TdT反应液中不加TdT或用TTP (三磷酸胸苷)取代生物素-16-dUTP。
4.统计学分析
在TUNEL染色切片上，计数每组动物睾丸500个生殖细胞中的阳性标记细胞，用t检验比较各组间有无显著性差异。
结 果
1.电镜观察形态学所见
在出生当日，可见个别呈坏死特征的变性生殖细胞，核质溶解，但无染色质聚集；核周隙扩大，线粒体和内质网等细胞器肿胀，有空泡形成。细胞膜有突起、出泡现象(图1)。生后1d，死亡细胞罕见。生后4d开始见到典型凋亡特征的生殖细胞，并于生后10～13 d达到高峰(图2)，而后凋亡细胞逐渐减少。凋亡生殖细胞早期出现核染色质聚集(图3)，细胞器如线粒体和内质网无明显变性；中期除核染色质积聚外，细胞器也肿胀变性(图2)；晚期细胞核碎裂，细胞器溶解，细胞常碎裂为几部分，成为凋亡小体(图2，4)。
图1 生后0d，生殖细胞的坏死图像 标尺示2μm
图2 生后10d，可见较多凋亡的生殖细胞，箭头示凋亡小体 标尺示2μm
图3 生后10d，生殖细胞凋亡的早期图像 标记示1μm
图4 生后18d，生殖细胞凋亡的晚期图像 箭头示凋亡小体 标记示1μm
Fig.1 0 day after birth, a necrotic figure of a germ cell. Bar=2μm
Fig.2 10 day after birth, many apoptotic figures of germ cells could be found. Arrows point
to apoptotic bodies. Bar=2μm
Fig.3 10 day after birth, an apoptotic figure of germ cell at early stage. Bar=1μm
Fig.4 18 day after birth, two apoptotic figures at late stage. Arrow points to a apoptotic body. Bar=1μm
2.TUNEL染色
图11 小鼠生后发育过程中睾丸生殖细胞的凋亡频率
前、后年龄组间均有显著差异(P<0.05)
不加TdT或用TTP代替生物素染色的切片全无着色。由于显色液加用硫酸镍铵和氯化钴，反应有浅灰色的背底。考虑到正常细胞中有一定量的DNA末端存在，因而仅深黑色着染的胞核被定阳性。在分布上，TUNEL阳性细胞有从曲精小管腔面向基底面逐渐外移的趋势。生后0～1d，未见到阳性细胞(图5)。在生后4～7d，曲精小管上皮仅一层细胞，生殖细胞与支持细胞镶嵌存在，生殖细胞比例很低，TUNEL阳性细胞多为位于曲精小管腔面未与基膜接触的生殖细胞(图6);10～13d时，生殖细胞增殖活跃，曲精小管生精上皮变为3～5层，TUNEL阳性细胞最为多见，在各层中均有分布(图7，8)；第18d时，TUNEL阳性细胞已经减少，虽在各层均可见到，但50%～60%位于第2层(图9)；50d时，TUNEL阳性细胞进一步减少，70%以上位于基底层(图10)。TUNEL阳性细胞在各发育阶段的出现频率见图11。
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