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小鼠雄性生殖细胞生后发育中的程序性死亡 |
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王瑞安 小路武彦** 郑平菊* 张远强 中根一穗**
(第四军医大学组织学胚胎学教研室，*西京医院肿瘤科，西安 710032；
**日本长崎大学医学部第三解剖)
摘 要 为了观察小鼠睾丸生后发育过程中生殖细胞自发死亡的方式与规律。用生后0、1、4、7、10、13、18和50d A/J系小鼠，一侧睾丸用2.5%戊二醛，另一侧睾丸用4%多聚甲醛固定18h后，分别用树脂或石蜡包埋，制备超薄和连续石蜡切片，进行电镜观察和TUNEL染色光镜观察。电镜观察显示，在出生当日，可见个别呈坏死特征的变性生殖细胞，核质溶解，但无染色质聚集。核周间隙扩大，线粒体和内质网等细胞器肿胀，有空泡形成。细胞膜有突起、出泡现象。生后1d，死亡细胞罕见。生后4d开始见到典型凋亡特征的生殖细胞，并于生后10～13d达到高峰。TUNEL染色见阳性细胞在生后4d开始出现，10～13d达高峰，而后逐渐减少，与电镜观察结果一致。结果表明：小鼠睾丸在发育过程中生殖细胞的自发死亡主要以凋亡的形式发生，在一定时期，则以坏死的方式出现。凋亡的发生与细胞的分裂增殖具有密切关系。
关键词 生殖细胞 程序性细胞死亡 凋亡 睾丸 原位末端标记 电镜 小鼠
动物胚胎及生后发育过程中常见组织细胞的退化变性［1～3］。在形体发生过程中，机体常产生比组织器官结构和功能的实际需要过多的细胞或一过性结构，如肾发生过程中的前肾与中肾。这些多余的细胞随后死亡而被清除。机体发生过程中正常发生的细胞死亡称为程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)［4］。在大多情况下，PCD以凋亡的形式发生［1］。细胞凋亡(apoptosis)是细胞死亡的一种方式，在形态上可见有细胞核染色质的积聚、断裂，而细胞器如线粒体和内质网等变化较小［5］。在睾丸的早期发生过程中，生殖细胞的PCD也很常见［6］。晚近一些作者对大、小鼠生殖细胞的死亡进行了研究，然而，有关生殖细胞正常发育过程中的自发死亡研究资料仍很有限。本实验用电镜观察及TUNEL (terminal deoxy-UTP nick end labeling)原位末端标记组织化学对小鼠生后发育过程中睾丸生殖细胞的死亡进行了研究。
材料和方法
1.动物及组织处理
实验用雄性A/J系小鼠，以出生当日为生后0d，分为0、1、4、7、10、13、18和50d共8个年龄组，每组3只动物，分别来自不同母鼠。所有动物均在午时断头处死，取睾丸，一侧用2.5%戊二醛-0.1 mol/L二甲砷酸钠缓冲液 (pH 7.2),另一侧睾丸用4%多聚甲醛-0.01 mol/L PBS(pH7.2)固定18 h，然后分别用Epon-812或石蜡常规包埋。石蜡包埋睾丸制成3 μm厚连续切片，裱贴于覆有氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane，美国Sigma公司)的载玻片上。
2.电镜观察
树脂包埋的睾丸组织制成半薄和超薄切片。半薄切片用甲苯胺蓝染色，超薄切片行硝酸铀和醋酸铅常规电子染色。用JEOL-1200电子显微镜在60 kV加速电压下观察。
3.TUNEL染色
TUNEL原位末端标记参照Gavrieli等［7］的程序略加修改。(1)切片经甲苯(toluene)和逐级酒精脱蜡入水，PBS洗5 min。(2)用3mg/L PBS蛋白酶K (Sigma产品)在37℃水浴中处理15 min，PBS洗3次，各 5min。(3)用末端脱氧核糖核苷转移酶(TdT)缓冲液(pH 6.6，含0.2 mol/L砷酸钾，0.025 mol/L Tris-HCl,0.25g/L BSA)在室温预孵育30 min，而后在37℃温箱进行标记反应1 h。标记反应液含：TdT缓冲液、0.1 mmol/L DTT(二巯基苏糖醇)、1.5 mmol/L 氯化钴、0.2U/L TdT(Boehringer Mannheim 产品)， 20 μmol/L dATP和10μmol/L生物素-16-dUTP(脱氧三磷酸尿苷)(Boehringer Mannheim)。(4)将切片移入0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液终止反应，置15 min后用PBS漂洗1 min。(5)0.3%甲醇双氧水处理30 min，灭活内源性过氧化酶。(6) PBS洗3次，各5 min。(7)0.5 g/L正常羊IgG-5%BSA-PBS室温孵育30 min。(8)HRP-羊抗生物素抗体(1：100，Dako, 1% BSA-P[1] [2] 下一页
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