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异双聚体电泳及其在遗传学差异筛选中的应用 |
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温博贵
摘要 介绍了一种灵敏、简便、快速测定双链PCR产物或DNA片断单个碱基差异的方法。该法借助常规PAGE电泳，能区分出有单个碱基错配而发生构型改变的异双聚体与碱基互补配对的同源双聚体双链DNA分子；并判断出序列中碱基错配的百分率。
关键词 异双聚体，遗传学筛选，电泳
中图分类号 Q523
A Heteroduplex Mobility Assay for Genetic Screening
WEN Bo-Gui
(Departement of Biochemistry, Medical College of Shantou University,Guangdong Province,Shantou515031)
异双聚体泳动测定法(Heteroduplex Mobility Assay HMA)是一种测定双链PCR产物或DNA片断单个碱基差异的快速方法, 该法通过普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)能将有单个碱基错配而发生构型改变的双链DNA片断显示出来〔1〕, 为准确地查找基因的碱基差异提供了一种简便的粗筛技术〔2〕。作者曾用此法对细菌基因PCR扩增产物DNA的遗传学差异进行了测定，结果满意，现将此法介绍于下：
1 原理
异双聚体系指：（1）遗传上不同源的两条DNA链在基因重组过程中，通过碱基配对形成的双链DNA。（2）两条不同源的DNA链在离体条件下，经退火形成的双链核酸分子，其中包含有一些不完全互补的碱基序列，它在PAGE电泳过程中表现为电泳迁移率降低, 且与DNA序列差异成比例（如：点突变、缺失及插入顺序等）。据报道〔3〕，对于0.7kb DNA片断，在200V电泳2.5 h，其DNA序列的差异度（<30%）可按下公式计算出：
差异度%（α）＝35.5－34.44（异双聚体泳动度）〕
异双聚体泳动度=二条异双聚体带平均移动距离/同源双聚体移动距离。
2 方法
2.1 聚丙烯酰胺凝胶制备
2.1.1 试剂 (1)40% 丙烯酰胺：称取39克丙烯酰胺加1克甲撑双丙烯酰胺，溶于水中，最终体积为100 ml。(2)5 × TBE Tris 54 g; 硼酸 27.5 g; 0.5 mol / L EDTA (pH 8.0) 20 ml 加水至1 L。(3)TEMED。(4)蒸馏水。(5)10% APS（过硫酸铵）。
2.1.2 凝胶制备方法 取40%丙烯酰胺5 ml；5 ×TBE 4 ml; 去离子水11 ml; TEMED 20 μl; 10% APS 160 μl; 加水至总体积20 ml。制备垂直板电泳凝胶。
2.2 样品制备（异双聚体生成）
10 μl DNA样品（待测），加5 μl 探针DNA样品（参考）。混匀，在液面上加一滴石蜡油。置95℃ 5 min缓慢冷至室温(40min 以上)。加2μl 含指示剂甘油样品缓冲液，离心1min。上样15μl 。
2.3 电泳条件
电泳缓冲液1×TEB，150V，4h 凝胶长8cm，适用于0.9 kb DNA片断。
2.4 凝胶染色与摄像
电泳毕取出凝胶，放入适量蒸馏水中，加入3 μl溴乙锭溶液，染色5min，倾去染色液，加入蒸馏水脱色至少1h。在紫外灯下观察凝胶，并摄像记录结果。
3 结果与讨论
本文应用口腔牙周病原菌之一牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalis W50, pg W50）作为参考菌，与受检者龈沟液中pg阳性标本分别进行rDNA间隙区PCR扩增。扩增条件及引物按文献〔4〕。pg W50 PCR扩增产物作为探针DNA（DNA参考序列），按前述生成异双聚体样品制备方法，与受检样品PCR扩增产物DNA混合，加热变性，退火，两种DNA的杂交产物进行PAGE电泳，结果如图1所示：（1）在电泳凝胶的前沿、下端均出现了DNA双链同源双聚体（Homoduplex）带，大约为0.88kb；（2）异双聚体出现在凝胶不同部位。比较每一行异双聚体带与同源双聚体泳动距离的差，大致可以看出受检样品PCR扩增产物DNA片断与DNA参考序列之间的错配程度。因为异双聚体构型改变后泳动速度明显小于同源双聚体。错配[1] [2] 下一页
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