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免疫新分子的发现及其研究进展 |
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曹雪涛
机体免疫应答的实质是免疫分子的相互识别和相互作用。免疫分子参与包括免疫细胞等在内的多种细胞的增殖分化及功能调节。一种重要免疫新分子的发现，往往会开辟一个新的研究领域，带动诸多相关学科的发展，对揭示免疫应答、炎症和造血细胞的分化发育等重大生命过程的本质及其调节规律产生深远影响；此外，一个重要的免疫分子本身就可作为一种蛋白质药物或作为药物设计的靶点，在抗肿瘤、抗感染、抗移植排斥、促进造血恢复和治疗自身免疫性疾病等方面具有潜在的临床应用前景。因此，免疫新分子的发现和研究具有重要的理论探索意义和实际应用价值，已成为当今免疫学乃至整个生物医学领域的热点，进展很快。本文着重就发现和克隆免疫新分子的策略以及该领域的研究热点作一述评，并简要介绍本室最近开展的相关工作。
1 寻找和克隆免疫新分子的策略
克隆未知免疫分子的经典策略是在已知其生物学活性或具备其相应的抗体或配体的情况下，通过筛选基因文库获得未知分子的全长cDNA；利用免疫沉淀技术能发现功能相关的未知蛋白，如通过抗CD3抗体免疫沉淀分离到了TCR的不同亚基，以及通过抗IL-6R α链抗体免疫沉淀发现了gp130信号传导链等［1］；通过差异显示或差减杂交寻找组织特异表达基因、利用PCR技术克隆同一家族的同源基因或利用酵母体系克隆新基因也是有效的途径；近年来，真核表达克隆(Expression cloning)的应用范围已被大大拓展，通过基因文库的随机大规模测序和EST的同源比较寻找和克隆免疫新分子更是大显身手，卓有成效。
1.1 核酸分子杂交筛选基因文库 已知部分核苷酸信息时，核酸分子杂交筛选基因文库是克隆新分子的基本策略。依据不同的情形，可利用不同的核酸分子作为文库筛选的基因探针。
1.1.1 寡核苷酸探针筛选 先通过蛋白纯化和氨基酸测序获得其少数氨基酸序列，从中推导出可能的核酸序列，根据遗传密码的简并性(Degeneracy)，合成一组寡核苷酸探针进行基因文库的筛选。这在新分子克隆的早期应用较多，许多细胞因子如IL-1、IL-2、IL-3、IFN-α、IFN-β和IFN-γ以及细胞因子受体CD25等［2］，就是先纯化到该蛋白，然后通过寡核苷酸探针筛选cDNA文库克隆到全长基因。目前该策略已基本被文库的表达筛选所取代。
1.1.2 核酸探针筛选 当对所需筛选的目的基因序列有所了解(如同源序列或基因家庭的保守序列等)或已获得部分基因片段(如来源于差异显示)时，通过制备核酸探针，采用经典菌落或噬菌斑印迹原位杂交方法克隆全长cNDA。利用大肠杆菌中参与DNA修复的RecA蛋白介导标记的单链DNA 探针与同源的双链DNA形成三链复合体的原理，通过生物素-亲和素磁珠标记系统可有效富集阳性克隆从而可快速筛选基因文库［3］。
1.2 抗体筛选原核表达文库 当具备未知免疫分子的抗体时，可用其筛选可能含有靶基因的原核表达文库。原核表达文库一般采用一套含有三种不同读框的系列载体(如Biolabs的pET系列)、以融合蛋白的形式表达目的基因，可通过定向克隆将cDNA片段插入载体，使任一具有读框的cNDA片段均可能产生正确的表达产物。利用该策略，曾成功克隆到包括肿瘤抗原在内的免疫分子。
1.3 真核表达文库的功能筛选 真核表达文库的功能筛选或称表达筛选(Expression cloning)是克隆未知免疫分子的有效途径。哺乳细胞作为基因文库筛选的宿主细胞，其最大优势在于能对蛋白产物进行正确的加工处理，使其以天然构象得到表达，可通过功能学及免疫学检测等方法进行筛选。真核细胞表达有稳定表达和短暂表达两种不同的策略。稳定表达筛选的局限在于获得稳定表达的转染细胞株比较费时，从宿主染色体DNA中分离转染的DNA比较困难。最初是将人肿瘤细胞中编码癌基因的基因组片段导入哺乳细胞进行稳定表达，用于筛选癌基因的基因组DNA。后来，稳定表达与免疫筛选相结合，成功分离了编码人HLA和β2微球蛋白基因组DNA，以及CD4、CD8的cDNA。短暂表达的优势在于能快速制备及筛选转染克隆株进行靶蛋白的检测，以及能从克隆细胞中有效回收编码cDNA。在具备快速而敏感的生物学检测方法时，直接通过检测短暂表达产物的特定生物学活性筛选表达文库分离细胞因子cDNA，无需先进行靶蛋白的纯化，这方法首先用于克隆GM-CSF cDNA［4］，后来还成功克隆了IL-4和IL-5的cDNA；此外，运用反应性T细胞还可进行肿瘤抗原的表达筛选。在具备抗体的条件下，将短暂表达与免疫淘选(panning)技术相结合能有效分离膜表面分子，如曾成功[1] [2] 下一页
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