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卵巢癌标志物CA125酶联免疫吸附分析法的建立 |
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/L pH 7.4磷酸缓冲液透析过夜后,加入等量的甘油保存于-20℃备用。有效期可达一年。经稀释实验,最佳酶标记物工作浓度为1:2 000。
1.2.2 CA125单抗的包被 将200 μl含CA125包被单抗的pH 9.6碳酸缓冲液(2 μg/ml)加至聚苯乙烯板上,4℃冰箱内放置过夜,然后加入含3%牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液中，于37℃封闭2.0 h后,酶标板可用于免疫反应。
1.2.3 标准的配制 将CA125抗原溶于经灭活的新生小牛血清中,配制成含10.00、30.00、80.00、200.00、540.00 U/ml的标准。用日本Centocor公司的CA125 IRMA 药盒校正标准值。
1.2.4 底物溶液和中止剂 将四甲基联苯胺100 mg、尿素过氧化氢13 mg溶于1 000 ml pH 5.0磷酸-柠檬酸缓冲液中，即为底物溶液,中止剂为2 mol/L H2SO4。
1.2.5 酶联免疫吸附分析法(ELISA) 采用一步法加样程序。 50 μl待测样品或标准和150 μl酶标记物加入包被CA125的酶标板中, 37℃温育3.5 h,弃反应液,用0.01 mol/L pH 7.4磷酸缓冲液(含0.05%Tween-20)洗板4次, 加入200 μl底物溶液, 避光显色30 min,再加入50 μl的2 mol/L H2SO4中止显色, 于450 nm测定其吸光度OD值。绘制标准曲线，计算待测血样CA125的含量。
2 结果
2.1 方法学的建立
2.1.1 标准曲线及灵敏度 图1为典型的CA125酶联免疫吸附分析曲线。 同时测定20个零标准，求其OD 450均值加上2倍标准差(+2s)，计算出本方法的灵敏度为2.00 U/ml。
图1 CA125酶免标准曲线
Fig.1 Standard curve of CA125
2.1.2 精密度 测定3个含有不同浓度的CA125人血清，观察批间、批内变异。结果见表1。
表1 批内与批间变异
Tab.1 Within-run and between-run
Within-run (n=22) Between-run (n=26)
A B C A B C
Average(U/ml) 27.67 75.49 199.31 25.22 80.40 186.95
SD(U/ml) 1.39 4.02 9.02 1.86 3.46 13.18
CV(%) 5.04 5.32 4.52 7.39 4.31 6.33
2.1.3 准确性 测定加入不同量的CA125标准品的样品，观察CA125的回收率，测得的回收率均值为100.9%(范围：91.1%～107.4%)。
2.1.4 稀释试验 取CA125含量较高的人血清，用小牛血清(零标准)进行倍比稀释。测定结果见表2。两样品的稀释倍数与测定值间的相关系数均大于0.990 0。
表2 稀释试验
Tab.2 Samples dilution
1 1/2 1/4 1/8 1/16 r
Sample 1 (U/ml) 281.30 138.30 71.10 32.60 15.80 0.999 9
Sample 2 (U/ml) 82.10 45.70 24.60 10.20 4.00 0.996 5
2.1.5 动力学实验 采用一步法，反应体系在37℃分别温育1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h，结果见图2，温育3.5 h免疫反应达到平衡，即为本方法的免疫反应时间。
图2 反应动力学
Fig.2 Reaction kinetics
2.2 正常参考值范围的确定 用本法测定了60例健康女性血样，CA125正常范围低于30.00 U/ml，均值为9.20 U/ml，与文献报道(＜35.00 U/ml)一致［4］。
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