|
微囊化猪胰岛对特异性抗体的免疫隔离作用的研究 |
| |
行纯化的海藻酸钠，经一步成囊法将新生猪胰岛样细胞团(Islet-like cell clusters, ICC)微囊化。然后把微囊化ICC(Microencapsulated ICC, McICC)和游离ICC(Free ICC, FICC)与经猪ICC免疫的小鼠新鲜血清共同孵育，再观察McICC和FICC的胰岛素释放的变化，以探讨海藻酸钠微囊对血清中特异性抗体的免疫隔离作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料 海藻酸钠、氯化钡、茶碱均为上海化学制剂厂产品。胰岛素放免试剂盒为中国原子能科学研究院同位素研究所产品。
1.2 方法
1.2.1 猪ICC的分离纯化及微囊化胰岛的制备 足月分娩出生1～4 d的新生猪，乙醚麻醉，无菌条件下取出胰腺，参照姜枫勤等人报道的方法稍加改进进行分离、纯化，获得ICC，置37℃、5%CO2的细胞培养箱中备用［1］。经双硫腙及台盼蓝染色，纯度90%以上，活细胞率90%以上。
将培养3～4 d的ICC分成2份，1份为FICC，1份参照Zekorn及姜枫勤等的方法进行微囊化［1，2］。每1 000个ICC加入15 g/L的精制海藻酸钠溶液1 ml，混匀后由自制微囊发生器喷入30 mmol/L的氯化钡溶液中使其成囊。倒置显微镜下见微囊外形完整，大小均匀，直径约400～600 μm。每个微囊含1～3 个胰岛，见图1。
图1 微囊化猪ICC(10×20)
Fig.1 Microcapsulated porcine ICC(10×20)
Note:diameter about 0.6 mm
1.2.2 小鼠免疫血清制备 出生50 d左右昆明种小鼠(山东医科大学动物中心提供)，体重28～30 g。取1×104 ml-1 ICC悬液，每只小鼠腹腔内注射0.2 ml。此后于10、20、30 d重复注射0.2 ml/只。50 d后于左、右眼眶内取血，分离血清，分成新鲜血清(2 h 内用于实验)及灭活血清(56℃、40 min灭活后用于实验)，同时留取正常小鼠血清。
把FICC分别与免疫小鼠的新鲜血清(未稀释及稀释一倍)、灭活血清、正常小鼠的新鲜血清及RPMI 1640培养液孵育24 h后，倒置显微镜下观察各组ICC形态，见未稀释免疫小鼠新鲜血清孵育后的FICC边缘模糊，细胞团发暗，一些形态不完整。同期RPMI 1640培养液中生长的FICC，边缘清晰完整，桔黄色，半透明。其余各组FICC的形态亦未见明显变化。
1.2.3 分组及步骤 分组McICC对照组：RPMI 1640液100 μl+McICC 100个。FICC对照组：RPMI 1640液100 μl+FICC 100个。免疫小鼠新鲜血清-McICC组：免疫新鲜血清100 μl+McICC 100个。免疫小鼠新鲜血清-FICC组：免疫小鼠新鲜血清100 μl+FICC 100个。免疫小鼠灭活血清-FICC组：免疫小鼠灭活血清100 μl+FICC 100个。正常小鼠新鲜血清-FICC组：正常小鼠新鲜血清100 μl+FICC 100个。
步骤：按上述分组加样于96孔细胞培养板，每个样本设3个复孔，于37℃、5%CO2培养箱内培养24 h，而后弃去上清液，用RPMI 1640液洗后，再做胰岛素释放试验。
1.2.4 胰岛素释放试验 各组分别加葡萄糖浓度为5.1 mmol/L的Tc199培养液200 μl/孔。置CO2培养箱内培养2 h，然后留取上清液待测胰岛素(为基础胰岛素)；再加葡萄糖浓度为16.7 mmol/L、茶碱浓度为10 mmol/L的Tc199培养液200 μl/孔温育2 h，留取上清液待测胰岛素(为刺激后胰岛素)。标本置-20℃冰箱内保存。
1.2.5 胰岛素放免测定 按照放免药盒说明进行胰岛素放免测定。每个样本3个复孔的平均值为该样本的胰岛素测定值。
1.3 统计学处理 实验数据以±s表示。采用多个样本均数两两比较的方差分析法，用SPSS统计软件包进行统计学处理。
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： LPS对人胚胎胰岛分泌IL
下一个医学论文： 多因素所致温病湿热证模型大鼠红细胞免疫功能的变化
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文