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SD乳鼠窦房结细胞原代分散培养的光电镜研究 |
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n P and T cells of SAN.The centrosome and a few electron dense granules near the nuclei were easily seen in the cytoplasm of polygonal cells.The chromosome appeared in nuclei of polygonal cells,and the cells was just at the prophase or metaphase in cell cycle. Conclusion The polygonal cells were infantile and proliferating cells.
【Key words】 SAN; Cell primary culture; Cell structure of light microscopy and TEM; Neonatal SD rat
迄今，在窦房结形态与功能的研究中，所用材料主要是在体组织、立体小标本及微小标本，近几年也有用酶消化窦房结组织块而得到的细胞团或单细胞［1，2］，它们数量有限，也不能传代，且操作过程中酶的消化及机械作用可使细胞活力大大减弱。在对窦房结单细胞作直接电生理和药理学研究时，体外培养的结窦房单细胞被认为是较前述更为理想的材料，但迄今国内尚未做此工作，国外也少有报道［3］。我们在新生SD大鼠窦房结的光、电镜定位研究的基础上［4，5］，取材做窦房结细胞原代分散培养，旨为窦房结形态和功能的研究提供有活力的数量充足的单细胞材料。
材料和方法
1. 材料
新生第4d SD大鼠360只，9次实验，每次40只，雌雄不拘。
2. 方法
2.1 窦房结细胞纯化培养：(1)将4d龄乳鼠体表用70%酒精擦洗后带入净化工作台内(苏州，YJ-875)，在大视场工作仪下，将鼠呈仰卧位固定，用碘酊、酒精消毒胸部皮肤，剪开胸前壁，暴露正搏动的心脏及前(上)腔静脉，于此静脉跟部取0.8×0.8×1mm组织块［5］；(2)按上述方法取材，将从各鼠剪下的组织块收集于盛有RRMI 1640培养液(美国，PRMI 1640)的培养皿中洗涤2次，再将组织充分剪碎，加入0.06%胰蛋白酶(美国Sigma,Difco 1∶250)，用尖嘴吸管轻轻吹打约2min，移至离心管，于37℃水浴中消化10min，自然沉淀，弃去上清，再加10～15ml 0.06%胰蛋白酶，再消化10min。多次消化，直至组织块成分散单细胞为止；(3)从第二次消化开始，每次消化后的细胞悬液吹打约2min，自然沉淀，吸取上清，并将上清分配至离心管中，每支离心管再加入等量1640液消除胰蛋白酶的消化作用，吹打，再离心1次，弃去上清，将沉淀的单细胞收集到有1640液的容器中；(4)将步骤(2)(3)后收集的各离心管中的单细胞沉淀集中制成单细胞悬液，加入10%～15%新生牛血清、1%～2%双抗，充分吹打、混悬后，分别吸入到预先置有玻片(1×1cm)的6孔或12孔培养板中，经红血球计数盘计数，最终细胞接种密度为1～10×155个/ml。另取细胞悬液0.9ml、0.4%台盼蓝0.1ml混匀，滴1滴于血球计数盘上数100个细胞，计算活细胞约达92%以上(活细胞不染色，死细胞被染成蓝色)；(5)将有活细胞的培养容器置于37℃、5%CO\-2培养箱中(日本，BNA-311D培养箱)，培养1.5～2h后，采用差速贴壁分离技术［6］，用吸管轻轻吸取培养孔中细胞悬液(因成纤维细胞贴壁快)，收集至另一容器中，按每2.7ml培养细胞悬液加1mmol/L 5-溴脱氧尿核苷(BrdU)(美国，Sigma)0.3ml，使BrdU终浓度为0.1mmol/L (BrdU主要抑制成纤维细胞生长)，继续培养，按每1～2d换液1次，前4次换液都使用BrdU。
2.2 对照培养：(1)常规培养 即窦房结细胞培养时不用差速贴壁技术，也不用BrdU处理培养液；(2)差速贴壁培养 即窦房结细胞培养时用贴壁分离技术但不用BrdU处理培养液；(3)窦房结细胞培养时，也分别取心房及心室肌组织作同步培养，以与窦房结细胞作鉴别。
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