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SLE患者TCR V 基因亚家族的表达特征及其克隆性 |
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RNA提取及逆转录合成cDNA参见文献［4］。RT-PCR及Southern杂交检测TCR Vβ基因亚家族的表达亦参见文献［5］。
1.2.1 RT-PCR 根据TCR Vβ 24个亚家族基因设计出相应的24个Vβ特异性上游引物，并在Cβ区设一Cβ下游引物，另外还在Cβ引物的左侧设一荧光素标记的Cβ-FAM引物（Cβ-Fam 5 -Fam-CACAGCGACCTCGGGTGGG）供基因扫描之用［6］。PCR的总反应体积为25 μl,其中含1 μl cDNA, 0.1 mmol/L dNTP, 引物浓度均为0.5 μmol/L（任一Vβ和Cβ引物），1.25 U Taq DNA聚合酶，共进行40个循环：94℃ 1 min（首次3 min）；60℃ 1 min；72℃ 1 min（末次10 min）；反应结束后保存于4℃中，各反应均设阳性和阴性对照，扩增产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
1.2.2 标记PCR产物 RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析发现阳性带者继而以Cβ-Fam为引物进行不对称PCR扩增，以得到荧光素标记的单链PCR产物，总反应体积为10 μl，包括2 μl首次PCR产物，0.1 μmol/L Cβ-Fam, 3 mmol/L MgCl2, 0.2 mmol/L dNTP, 0.25 U Taq DNA聚合酶，反应共进行35个循环：94℃ 1 min；66℃ 1 min；72℃ 1 min（末次10 min）。
1.2.3 基因扫描分析T细胞克隆性 经标记PCR反应后得到的产物1 μl，加入2.5 μl甲酰胺，0.5 μl标准品（ABI, Genescan 500-Tamra,其中含有不同大小的荧光素标记的DNA片段）及0.5 μl加样缓冲液（含葡聚糖蓝50 mg/ml和EDTA 25 mmol/L），94℃变性4 min后于6%聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并用373A DNA序列分析仪（Perkin Elmer公司）分析结果，通过分析软件GeneScan672、激光扫描及计算机收集电泳过程中不同时间所出现的不同强度和颜色的荧光素而显示出不同的位置、高度、颜色和形态的峰。荧光素Fam 呈蓝色而Tamra则呈红色，峰的位置表示产物的大小（与标准品相比），高度表示产物的量，而形态则代表产物的均一性，若所含的DNA片段大小相同，则其基因扫描结果表现为单峰；若绝大多数DNA片段大小相同，则呈一主峰及个别矮峰；若产物中DNA片段大小不一，其基因扫描结果就呈多峰图象，这三者分别提示产物来自单克隆、寡克隆和多克隆T细胞。
2 结果
2.1 分离6例SLE患者外周血淋巴细胞，采用RT-PCR-Southern杂交分析TCR Vβ 1～20基因亚家族的表达特征，发现其均表现为Vβ 8和Vβ 16表达水平增高，见图1和表1。
2.2 T细胞克隆性的分析，采用Vβ 1～-24/ Cβ引物进行RT-PCR扩增后，5例正常人外周血表达除Vβ 20外的其他Vβ亚家族T细胞；4例SLE患者外周血淋巴细胞检测结果为：例1表达Vβ 2、Vβ 3；例2表达Vβ 2；例3表达Vβ 9；例4则表达Vβ 2。进而将这些阳性产物用基因扫描分析后发现6例正常人全部PCR产物均呈多峰图象，提示产物大小不一，即来自不同克隆的T细胞（多克隆）；例1、例2所表达的Vβ产物亦为多峰图象，即来自多克隆T细胞；而例3所表达的Vβ 9产物和例4表达的Vβ 2产物则呈一主峰及个别矮峰图象，即来自寡克隆T细胞，如图2所示。
图1 TCR Vβ 1-20基因亚家族在正常和SLE患者淋巴细胞中的表达
Fig.1 TCR Vβ 1-20 gene subfamily expression in peripheral blood lymphocytes from healthy controls and patients with SLE
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