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大鼠神经垂体催产素能神经元内神经分泌颗粒的免疫电镜观察 |
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［6，7］，使得对这一问题的深入研究成为可能。本实验应用包埋后免疫电镜方法，对大鼠神经垂体OT能神经元轴突及终末内囊泡的形态特征和免疫反应性的差异性进行观察。
材料和方法
1.动物取材
SD大鼠4只，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，心脏灌注固定。固定液含1%多聚甲醛+1.25%戊二醛+0.01mol/L PBS，pH7.3。动物静置，4℃，3h后，取出脑垂体，振动切片200μm，解剖镜下分离出神经部，置入0.01mol/L PBS保存过夜4℃。
2.组织处理及电镜包埋过程［7］
振动切片经：(1)含0.5%OsO4+0.5%HgCl+0.5%KMnO4的生理盐水4℃ 30min；(2)30%、50%、70%、80%丙酮，每次1min;90%、100%丙酮，每次5min,各级丙酮均为4℃，含0.5%HgCl;(3)含0.5%HgCl的100%丙酮，-20℃，3h，然后转入4℃，1h，经纯丙酮换3次，Epon 812定向包埋。超薄切片，贴镍网。
3.电镜免疫细胞化学反应
超薄切片经：(1)含1%鱼胶蛋白PBS封闭，10min;(2)兔抗OT血清(1∶800)室温过夜；(3)1%鱼胶蛋白封闭10min;(4)金标A蛋白(1∶60)室温2h。铅、铀染色，电镜观察。对照组用正常兔血清替代一抗。
结 果
电镜观察显示，OT能神经元轴突的不同部位的囊泡在形态、分布及免疫标记方面存在一定的差异。
1. 在非终末的轴突中可见不同类型的颗粒囊泡
一种为散在分布的颗粒囊泡，囊泡边界较清晰，电子密度较高且均匀。OT免疫细胞化学显示，可见明显的金标颗粒标记(图1，2)。另一种为集合分布于微管之间的颗粒囊泡，OT免疫染色呈阴性。囊泡主要由多个颗粒囊泡集合而成，有些囊泡边界模糊，囊泡内电子密度较低，整个集合囊泡群外周边界较清晰，似有膜性结构包裹。两种囊泡主要位于微管之间的间隙内(图1)。也可见散在分布的OT免疫染色阴性的颗粒囊泡位于微管之间(图2)。
2. 在轴突终末可见两种类型囊泡
一种为弥散分布的颗粒囊泡，呈OT免疫反应性，位于清亮小泡附近。有些OT阳性标记的颗粒囊泡贴附细胞膜，个别颗粒囊泡与细胞膜融合形成的胞吐现象(图3，图4)。在轴突终末周围间隙内，可见到OT阳性标记颗粒的内容物(图4)。另一种为成群分布的小圆形清亮囊泡，位于轴突终末靠近细胞膜处，部分清亮小泡膜与轴膜相邻，OT免疫染色呈阴性(图4)。
3.对照组切片
神经垂体内未见阳性标记的OT能神经元轴突。
讨 论
本实验发现，大鼠神经垂体OT能神经纤维轴突不同部位中所含的囊泡，不仅在形态、分布方面存在差别，而且各种囊泡对OT免疫反应性也明显不同，表明OT能神经纤维内的囊泡具有异质性。
Morris曾报道［1］，大鼠神经垂体无髓神经纤维的某些轴突终末内含有两种不同形态特征的囊泡。即散在分布的大颗粒囊泡和成串分布的小清亮囊泡，但未对这些囊泡进行定性标记。我们应用包埋后免疫电镜技术，对OT能的神经终末进行显示，不仅在OT免疫染色阳性轴突终末观察到与Morris报道相似的两种类型的囊泡，并且发现其终末内的两种类型囊泡对OT免疫反应性有明显差异。其中大颗粒囊泡呈OT免疫反应性，而小清亮囊泡则无OT免疫反应性。文献报道，神经垂体的神经纤维内，新形成的颗粒囊泡，常借助微管首先被运至轴突终末［8］。因此，我们认为，在OT能神经终末内观察到的大颗粒OT反应性囊泡应属于新形成的成熟囊泡，并且是OT释放的主要来源。但OT能神经终末内小圆清亮小泡的功能意义尚不清楚。有学者报道，神经垂体无髓神经终末可吞饮其周围某些成分，这些成分可能为OT或VP附产物，继而以膜包小泡的形式逆向运输至胞体［9］。因此，我们推测这些清亮小泡可能与轴突吞饮过程有关。
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