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云南纵坑切梢小蠹四个地理种群同工酶比较研究 |
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icus piniperdaL.)是松科树木的主要蛀食性害虫〔1〕。一般情况下，该虫主要危害生长衰弱的树木，但若环境条件适宜或蠹虫种群发生量大时，也可危害健康树木，导致树木枯萎死亡〔2〕。70年代以来，纵坑切梢小蠹在云南中、南部的广大地区大发生，危害云南松(Pinus yunanennsisL.)松林数十万公顷，其中十多万公顷森林被完全毁灭〔3〕。1986年以来, 我们对纵坑切梢小蠹的种群动态、取食为害、空间分布、化学信息物质等方面进行了较多研究〔3, 4, 5〕。调查发现，纵坑切梢小蠹在云南不同地区的危害程度也轻重不一。造成蠹害差异的原因与当地生态环境有密切关系，同时也可能涉及到蠹虫种群的遗传因素。因此，探索不同地区蠹虫种群的遗传特征及各种群间的遗传关系，进而揭示其与危害行为之间的内在联系，对于深入认识蠹害的地区分布及发生机理具有重要意义。
同工酶电泳技术是研究种群遗传结构的常用方法之一〔11, 14〕。本文应用同工酶电泳技术，对云南由北向南4个纵坑切梢小蠹种群进行了同工酶比较研究。通过对这些种群同工酶基因座等位基因频率的分析，探索了各种群间的遗传关系，并结合4个地区蠹害发生情况对形成基因频率差异的原因进行了探讨，以期为全面揭示纵坑切梢小蠹危害机理提供一些基础信息。
1 材 料 和 方 法
1.1 采虫地点
供试验用蠹虫分别采集于丽江大研镇后山（海拔2 499米；东经100°14 ; 北纬26°53 ）、楚雄紫溪山（海拔1 800米；东经101°34 ；北纬25°3 ）、路南长湖（海拔1 900米；东经103°25 ；北纬24°43 ）和蒙自石岩寨附近（海拔1 550米; 东经102°13 ; 北纬24°51 ）。前3个地点为云南松纯松林，蒙自石岩寨为思茅松纯松林。路南长湖和蒙自石岩寨附近的蠹害较为严重，蠹虫种群较大。楚雄紫溪山的蠹虫种群较小蠹害稍轻，但近年均有蠹害死树出现。丽江大研镇后山松林内的蠹虫种群较小蠹害轻微，蛀害死树仅偶尔可见。
1.2 试虫处理
试验用虫均为小蠹虫当年新羽化成虫，直接从蛀害松树上获得。每只蠹虫先在显微镜下作形态鉴定，确保蠹虫虫种准确无误。对每只蠹虫分别用蒸馏水清洗，然后用150μl匀浆液（0.05 mol/L Tris-HCl, pH7.0）匀浆，经3min 6 000r/min离心，取上清液存于-20℃冰箱中备用。
1.3 电泳方法
本研究分析了5个酶系统：酯酶（Es，EC 3.1.1.1）、苹果酸脱氢酶(Mdh，EC 1.1.1.37)、天冬氨酸转氨酶(AAT，EC 2.6.1.1)、酸性磷酸酶(ACP，EC 3.1.3.2)、超氧化物歧化酶(SOD，EC 1.15.1.1)。各同工酶组分采用无SDS Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳分离〔6〕。各种酶所需凝胶的配制方法如下。
酯酶（Es）：8% 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶(pH8.9), 5% 浓缩胶(pH6.8)和高离子强度Tris-甘氨酸缓冲系统（pH8.3）。
苹果酸脱氢酶(Mdh)、酸性磷酸酶(ACP)和超氧化物歧化酶(SOD): 6% 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶（pH8.9), 2.5% 浓缩胶（pH6.8）和低离子强度Tris-甘氨酸缓冲系统（pH8.3）。
天冬氨酸转氨酶(AAT)：8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶（pH8.9），5%浓缩胶（pH6.8）和低离子强度Tris-甘氨酸缓冲系统（pH8.3）。
为了便于在一致的条件下作酶谱比较，4个种群各个体均分别点样于同一凝胶板上，每孔30μl。每块凝胶板可同时对10～12个样品进行电泳。电泳开始时凝胶板控制电流为10 mA,样品从浓缩胶进入分离胶后，电流升为20 mA，恒定电流，在室温下电泳。当溴酚蓝示踪染料迁移至离凝胶底部1cm时，关闭电源，停止电泳，立即取出凝胶冲洗数次，将凝胶置于染色溶液中，在恒温箱内或室温下染色。
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