|
线粒体DNA与人精子活力间的相关性分析 |
| |
些多肽与细胞核DNA编码生成的多肽一起参与OXPHOS［1］。细胞通过OXPHOS产生的ATP占细胞生命活动所需能量的90%以上，因此mtDNA对维持细胞的正常功能起重要的作用。但mtDNA易发生突变，其突变率比核DNA高出5～10倍，由基因损害导致OXPHOS的异常主要是由于mtDNA而不是核DNA突变所造成［2，3］。近年来研究发现，mtDNA缺失(deletion in mitochondrial DNA,DmtDNA)与人类衰老和多种疾病有关［2，4］。线粒体鞘是精子的重要结构之一，mtDNA突变与人类男性不育症，特别是精子活力低下不育症是否有关也引起了人们的关注。我们运用长链PCR(long polymerase chain reaction,LPCR)技术对精子活动力正常及活动力低下不育患者精子mtDNA进行了多重缺失(multiple deletions)的分析，以观察mtDNA缺失与精子运动的关系，现将结果报道如下。
材料和方法
1.标本来源和采集
60例精子活力正常及40例活力低下不育患者均来自不育专科门诊，禁欲3～5d，手淫法采集精液，37℃孵育30min液化后进行观察。
2.实验方法
2.1 精子活力测定：按照WHO标准，将精子活力分为4级：A.快速向前运动；B.慢或呆滞的向前运动；C.非前向运动；D.不动。其中，A级活力>25%或A+B级活力>50%为正常。
2.2 精子DNA的提取：取2ml精液标本3 000 r/min离心10min，将沉淀加入300μl细胞裂解液(其中含10mmol/L Tris-HCl,pH8.0，0.5mol/L EDTA,10%十二烷基磺酸钠，0.1%蛋白酶K)，55℃ 2h，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)，12 000r/min离心10min，移上层水相入新管，加1／10体积3mol/L醋酸钠(pH 6.0)，2.5倍体积无水乙醇沉淀DNA，离心浓缩DNA，Tris-HCl缓冲液溶解，-20℃保存备用。
2.3 LPCR引物：LPCR引物参照Cheng等［5］设计，并与mtDNA核苷酸序列核对无误。引物序列如下：RH1065(L14841)：5’-TGAGGCCAAA-TATCATTCTGAGGGGC-3’；RH1066(H15149)：5’-TTTCATCATGCGGAGATGTTGGATGG-3’。期待扩增产物为16.3kb，扩增片段中包括mtDNA的全部编码RNA和多肽。该引物由上海植物生理研究所合成。
2.4 LPCR：LPCR采用ExpansTMLong Template PCR System(Boehringer Mannheim产品)，反应体系为2.25mmol/L MgCl2，350 μmol/LdNTPs，2.62U聚合酶混合物及LPCR buffer,300nmol/L引物×2，总反应体积为50μl。反应置94℃预变性2min，94℃变性10s，68℃退火30s，共30个循环，后20个循环中每个循环68℃延伸10min后再自动延伸20s。取5μl扩增产物置0.8%琼脂糖凝胶(含10g/L溴乙锭)，40V电泳1.5h，观察结果。
2.5 LPCR产物定量分析：采用Thermal Imaging System(Pharmacia产品)，Imagemaster○ RVDS软件包分析。
2.6 缺失型mtDNA(DmtDNA)序列测定；S5号标本DmtDNA从上游引物起，应用全自动测序分析仪对DmtDNA片段进行测定，分析DmtDNA的点突变和片段缺失情况。
结 果
1.精子活力测定
60例精子活力正常(S1～S60)不育患者精子活力测定均为A级+B级活力精子≥50%，40例精子活力异常(F1-F40)不育患者精子活力测定均为A级活力精子<10%，且A级+B级活力精子≤30%。
2.LPCR检测
电泳结果显示，60例精子活力正常不育患者中，6例患者(S1，S2，S5，S28，S31，S47)具有mtDNA的多重缺失，其中S5号标本16.3kb扩增条带较弱，而DmtDNA条带很强。40例精子活力异常不育患者中2例患者(F9，F11)具有mtDNA的多重缺失，其他标本未见多重缺失(图1)。
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 肾上腺素对培养的大鼠表皮细胞增殖的影响
下一个医学论文： 奥替普拉和反义GST
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文