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一株特殊功能的抗人CD40单克隆抗体的获得及其生物学特性分析 |
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dritic cell Multi-myeloma
CD40是分子量为50 kD的细胞表面受体，表达于许多类型细胞，包括B细胞及抗原递呈细胞，是I 型跨膜糖蛋白，其基因定位于20q11，属神经生长因子受体(NGFR)/肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族成员［1］。CD40分子的激发及在其它一些因子协同作用下，可以促使B细胞的增殖、分化、Ig分泌及其类型转换［2］；同时CD40分子在树突状细胞和T淋巴细胞的激发及功能介导中也具有重要的作用［3］。文献所报道的抗CD40单克隆抗体（MAB89和G28.5）因其能与IgM抗体或佛波脂（Phorbol esters）协同作用致使纯化的B细胞扩增、分化、介导Ig的分泌及其类型转换而著名［4］。同时能否运用这类功能性单抗来研究其它免疫细胞（例如DCs）CD40分子的生物学效应，值得进一步探讨。本室成功获得一株稳定分泌鼠抗人CD40分子的杂交瘤细胞株（克隆5C11）。继而用纯化的单抗为工具，进一步探讨了CD40分子在正常B细胞的增殖、树突状细胞体外激发、扩增和分化成熟中的作用，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 XG1、XG2、XG6、XG7 是本室建立的多发性骨髓瘤细胞系，置于含10%胎牛血清及rIL-6 3 ng/ml的RPMI1640（Gibical 公司）中常规培养，其中XG2的CD40分子的表达异常高（阳性率为99%，荧光强度达 625），这为研制鼠抗人CD40分子的单克隆抗体提供了良好的抗原物质；B淋巴瘤细胞株Daudi，T急淋巴细胞株Jurkat（均购自ATCC）用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基在37℃，5%CO2中长期培养。LCD32为转染FcγRII（人CD32）的鼠成纤维细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养（法国B.Klein博士赠送 INSERM.U475）。这些细胞株均无支原体污染。
1.2 单克隆抗体的制备 将XG2细胞每只鼠107/500 μl（注射前经丝裂霉素处理）加入等体积的福氏不完全佐剂，免疫Balb/c小鼠（间隔3 w，共3次）。在末次免疫的第4天取小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞株按常规方法进行融合［5］ 。以XG2 细胞（阳性对照）及XG7细胞株（阴性对照），用间接免疫荧光法对杂交瘤培养上清进行初步筛选。继而用Daudi（阳性对照）及XG1细胞（阴性对照）作进一步筛选，阳性克隆以有限稀释法单克隆化。经过3次有限稀释法亚克隆，使克隆的阳性率达99%，并在体外持续传代，分批冻存。
1.3 单抗的特性鉴定 McAb 5C11效价测定：诱生腹水按本室建立的常规方法进行，效价测定采用间接免疫荧光法；McAb的Ig亚类测定，采用试纸快速测定（Argen公司，法国）；腹水型McAb 5C11的纯化及定量：按Pharmacia公司方案采用Protein G柱分离纯化，定量采用染料结合比色法（BSA标准蛋白作对照）［6］；CD40分子在各类细胞系上的表达：采用常规的间接免疫荧光法，用流式细胞仪分析；抗体识别抗原位点的竞争实验：XG2及Daudi细胞1×106，先用纯化后的McAb 5C11 10 μg/100 μl孵育45 min, PBS洗涤2次，加鼠抗人CD40-PE 直标单抗（克隆MAB89，购自法国Immunotech公司）2 μg/100 μl孵育30 min，同时用CD40-PE 2 μg/100 μl作为阳性对照，鼠IgG1-PE（购自法国Immunotech公司）为阴性对照，用流式细胞仪分析细胞膜荧光表达强度；McAb 5C11的Western blotting 鉴定：将XG2、Daudi、XG7、XG2-B7、Jurkat细胞各1×107用PBS洗2遍后，去除上清，加入50 μl 1×的加样缓冲液，在水中煮沸15 min，用10%SDS-PAGE凝胶进行分离，一抗为5C11，二抗为羊抗鼠Ig-POD （购自德国Boehringe公司），显色按该公司Western blot kit所提供的方法进行。
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