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铜绿微囊藻毒素的肝细胞毒性及活性氧生成作用 |
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2.大鼠肝灌流和原代肝细胞培养：大鼠肝灌流的方法参照文献［7］。大鼠为体重200 g左右的雄性SD大鼠，采用四型胶原酶灌流消化肝细胞的方法。肝细胞先在10%胎牛血清的William培养基中(Sigma公司)培养2小时，每瓶接种4×106个肝细胞。2小时后，用Hepes缓冲液冲洗细胞3次以洗去未贴壁的细胞，然后加入10 ml未含胎牛血清的William培养基。
3.肝细胞毒性试验和抗氧化剂DFO的保护作用：根据提取的粗毒素设置三种不同浓度作用于培养的肝细胞，其终浓度分别相当于每ml 1.25 μg干藻细胞，中浓度为相当于每ml 12.5 μg干藻细胞和高浓度为相当于每ml 125 μg干藻细胞。每个浓度设3个平行培养瓶，对照为去离子双蒸水。培养24小时后，检测培养基中释放的乳酸脱氢酶(LDH)，同时测定总乳酸脱氢酶(total LDH)，最后计算各培养瓶占总乳酸脱氢酶的百分率。在时间效应(time-course)的研究中，藻毒素浓度采用每ml 125 μg干藻细胞，各试验均重复3次以上。
在浓度为每ml 125 μg干藻细胞试验组中，同时加入浓度分别为1 mmol/L，5 mmol/L和10 mmol/L的DFO，并计算各培养瓶占总乳酸脱氢酶的百分率。
4.活性氧类(ROS)的检测和抗氧化剂DFO对ROS生成的影响：ROS的检测参照文献［7］，采用DCFH-DA(Molecular Probes.Inc.)荧光探针的方法。
5.统计方法：数据以均数±标准误或均数±标准差表示，分析使用SPSS的ONEWAY ANOVA Scheffe s test和Student s test，P值小于0.05为有显著性意义。
结果
1.铜绿微囊藻毒素的肝细胞毒性：在剂量-反应研究中，当藻毒素浓度为中，高浓度时(即分别相当于12.5 μg干藻细胞/ml和125 μg干藻细胞/ml)时，与阴性对照相比具有显著性意义(P<0.01)，见表1。在时间效应研究中，藻毒素仅作用了6小时，LDH的释放百分率与阴性对照比已具有了差异显著性(P<0.05)，见表2。
表1 藻毒素作用肝细胞LDH释放率的剂量-反应研究
藻毒素浓度
(μg干藻细胞/ml) LDH百分率
(%，±s，n=3)
0 21.05± 5.23
1.25 23.96± 5.48
12.5 43.73±12.39*
125 78.12±15.73*
*P<0.01
2.DFO对铜绿微囊藻毒素肝细胞毒性的保护：当DFO浓度为1 mmol/L时，藻毒素作用肝细胞的LDH的释放百分率的降低已具差异有显著性(P<0.01)，DFO浓度为了10 mmol/L时，LDH的释放百分率可以降低达50%以上，说明DFO对铜绿微囊藻毒素的肝细胞毒性有显著的保护作用，见表3。
3.铜绿微囊藻毒素对肝细胞活性氧类(ROS)生成：当藻毒素仅作用了60分钟后，其荧光强度即和阴性对照具差别有显著性(P<0.01)，见表4。
4.DFO对铜绿微囊藻毒素肝细胞活性氧类(ROS)生成的抑制：当DFO浓度为1 mmol/L时，即可以显著地降低藻毒素作用的肝细胞所生成的ROS(P<0.01)，并且有明显的剂量反应关系，见表5。
表2 藻毒素作用肝细胞LDH释放率的时间-效应研究
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