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马铃薯天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因转化烟草研究 |
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基因和谷类半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因转移到水稻中获得了具抗虫效果的转基因水稻。1998年，Urwin等〔7〕利用多肽连接子将一半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因和丝氨酸蛋白酶抑制剂基因共同转入水稻中获得了含有双重蛋白酶抑制剂基因的转基因水稻植株，并且证明这种转基因植株比这两种基因的任一单基因的转基因植株更具明显的抗虫效果。
与此同时有关天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因的研究却比较少，1990年Strukelj等〔8〕报道了一马铃薯天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因的cDNA序列，1992年，Majanja等〔9〕利用该cDNA探针筛选出了基因组DNA序列。天冬氨酸蛋白酶抑制剂不仅可抑制天冬氨酸蛋白酶，还可抑制胰蛋白酶。从我们报道的马铃薯天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因序列〔10〕以及他人报道的几个天冬氨酸类的蛋白酶抑制剂基因序列〔9，11，12〕来看，均含有抑制胰蛋白酶的活性中心即精氨酸的密码子。天冬氨酸蛋白酶活性的最适pH值为3～5，而鞘翅目和半翅目类的昆虫与其他许多肠道呈碱性的昆虫不一样，其肠道pH值为3～5〔13，14〕，为天冬氨酸蛋白酶提供了最适作用环境，因而天冬氨酸蛋白酶抑制剂可能对这两类昆虫发挥作用。1998年Kreft等〔15〕通过Northern杂交证实在马铃薯块茎中天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因的转录活性最高，紫茉莉酮酸可诱导mRNA的急剧表达。而目前关于利用天冬氨酸类蛋白酶抑制剂基因培育转基因植物的研究还未见报道。
1 材料和方法
1.1 材料
限制性内切核酸酶XbaI、KpnI，T4DNA连接酶为北京华美生物工程公司产品。切口平移试剂盒，[γ-32P]ATP和[α-32P]dCTP为北京亚辉生物工程公司产品。尼龙膜为Sigma公司产品。其余试剂均为国产分析纯产品。
含有质粒pAPI189、pGA643的大肠杆菌JM109，含有辅助质粒pRK2013的大肠杆菌HB101，Agrobacterium LB4404为本室保存。烟草（N.ruslica）种为大叶烟。
1.2 方法
1 .2.1 重组表达质粒pGAPI的构建
表达质粒构建如图1示，根据常规碱法提纯质粒pAPI189和pGA643 的DNA ，分别利用XbaI和KpnI进行双酶切，利用电洗脱法回收目的基因即马铃薯天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因DNA片段及pGA643 的载体DNA片段。通过T4 DNA连接酶的连接转化CaCl2法制备的大肠杆菌JM109的感受态细胞，然后快速提取质粒DNA初步筛选含有目的基因的重组质粒。常规碱法提纯待检质粒DNA 经XbaI 和KpnI双酶切检测，进一步利用针对目的基因的特异引物进行PCR 检测，以确定是否获得了含有目的基因的重组表达质粒pGAPI。
1.2.2 利用三亲融合法转化农杆菌
分别培养含有表达质粒pGAPI3的大肠杆菌JM109（LB＋50μg/ml Km＋12.5μg/ml Tet , 37℃）、含有辅助质粒pRK2013的大肠杆菌HB101（LB＋25 μg/ml Km,37℃）、含有Ti质粒的农杆菌LB4404（YEB＋20μg/ml Rif,30℃）。三种菌株各取5ml液体培养物混匀5分钟涂布于无抗生素YEB平板培养，第二天刮取菌苔划线培养于YEB平板（50μg/ml Km＋25μg/ml Tet＋20μg/ml Rif ）以筛选含有目的基因的三亲融合农杆菌作转化用。
1.2.3 农杆菌介导转化烟草
取大叶烟的种子2％ HgCl2处理10分钟，灭菌水冲洗5次后用灭菌滤纸吸干多余水分接种于50ml 固体T-培养基〔16〕的三角瓶中16小时光照、8小时黑暗培养，温度为26℃。取四周龄叶片利用打孔器打出1cm2的叶圆片放于三亲融合菌的液体培养物中处理5分钟，无菌滤纸吸干菌液28℃暗培养于20ml T-培养基3天，取出叶圆片培养30ml 固体分化培养基中（T-培养基 100μg/ml Km＋300μg/ml Cef＋1μg/ml 6-BA ）中，培养条件16小时光照、8小时黑暗、26℃。每隔两周更换一次新鲜T-培养基。
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