|
敲除AT1a基因对血管紧张素II受体介导的信号传导作用 |
| |
协同作用的结果？ 剔除AT1a基因是否能充分阻断AngⅡ所致的增压反应及血管细胞重塑?常规的研究手段很难回答上述问题。近年来，建立的基因敲除或打靶（gene knockout or gene targeting）技术为研究目的基因的体内功能和相关疾病的致病机制提供了有利手段［3］。本研究应用敲除AT1a基因的血管平滑肌细胞（VSMC），观察敲除AT1a基因对AngⅡ的信号传导通路有什么影响，进一步明确AT1a在血管功能调节中的作用。
资料与方法
1．血管平滑肌细胞培养及基因型分析：AT1a基因敲除小鼠及野生对照型小鼠的主动脉VSMC，由美国北卡大学病理系Sonny H Zhang博士提供，方法简述如下：分离小鼠主动脉，去除血管内皮及结缔组织后，将中层血管平滑肌切成1 mm2小组织块作贴壁培养，获得原代细胞后，再传代培养，培养的VSMC经免疫组化和形态学观察证实，本研究所用细胞为6代以内。按文献报道［4，5］，分析细胞基因型和基因表达，采用Southern blot及RT-PCR方法。细胞DNA经限制性内切酶HindⅢ切割及应用特异性DNA探针，AT1a基因敲除细胞（AT1a-）产生一5.0 kb的条带，而野生对照细胞（WT）产生一3.3kb的条带，RT-PCR显示AT1a- 无AT1amRNA表达，而AT1bmRNA表达明显增强，而在WT，AT1bmRNA和AT1amRNA同时表达。
2. 钙信号传导通路的研究： 应用荧光双波长倒置显微镜系统（PTI104B），将培养的VSMC经Fura-2/AM染色后，按文献［6］的方法观察细胞内钙信号的变化，实验中应用GTP-βs拮抗G蛋白及Genestein特异性地抑制酪氨酸激酶，AngⅡ用于刺激细胞内钙，细胞钙浓度单位为nmol/L。
3. 统计学分析：数据以±表示, t检验，P＜0.05为有统计意义。
结果
1.对照组VSMC基础钙浓度，AT1a- 为（102±8） nmol/L，WT为（90±6） nmol/L，予100 nmol/L AngⅡ刺激后VSMC钙净增值（ΔCa2+），在AT1a-为 (308±27) nmol/L (n=28），WT为（254±21） nmol/L,(n=30)，AT1a(-)钙的基础值及ΔCa2+与WT相比差异无显著性（P＞0.05）。
2. VSMC与100 μmol/L G蛋白拮抗剂GDP-βs作用30分钟，VSMC的钙基础值，AT1a- 为（88±8） nmol/L (n=17)，WT为（74±4） nmol/L (n=8)，分别与对照组的钙基础值相比差异无显著性(P＞0.05）。VSMC经与GDP-βs作用后，AngⅡ刺激所致的ΔCa2+较对照组明显下降（P＜0.01），AT1a- 为（55±8）nmol/L（n=17），WT为（56±15） nmol/L (n=8)（图1）。
图1 GDP-βs对AngⅡ的作用
3.VSMC与特异性酪氨酸激酶抑制剂Genestein（100 ng/mL）作用30分钟，VSMC的钙基础值在AT1a(-) 和WT分别为（121±8） nmol/L (n=19)及（103±7） nmol/L（n=15），两者与对照组钙基础值相比差异无显著性(P＞0.05)。Genestein能显著抑制AngⅡ诱导的钙增加，ΔCa2+在AT1a-及WT分别为（70±17） nmol/L (n=19)和（90±22） nmol/L (n=15)，与对照组相比，P＜0.01（图2）。
图2 Genestein对AngⅡ的作用
讨论
目前，研究疾病的致病或相关基因主要通过两种策略：一为根据表型或性状的变化研究导致表型和性状变化的相关或侯选基因；另一为依据特异基因的变化研究相关的表型改变［7］。基因敲除的主要思路是通过改造致病基因或相关基因来研究该基因的体内功能及其在疾病发生中的作用。
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 氯沙坦干预病毒性心肌炎恢复期 慢性期心脏胶原表达及心功能的实验研究
下一个医学论文： 心房颤动患者经静脉体内电复律术后早期心房颤动复发及电生理机制的研究
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 内科论文 >> 正文