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预防血管成形术后再狭窄的C |
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leotides, C-sis PS-AODN)碱基序列如下：3′TACTTAGCGACGACCCGC5′
1.2 试剂 盐酸甲氧乙心安(内标，广州何济公药厂提供，纯度99%)；乙腈(分析纯)；去离子水(广东省心血管研究所临床药理实验室Milli-QRG超纯水系统Ultra-pure Water Systen自制)；胎牛血清(天津中科院产品)；灭菌注射用水(广州番禺市桥制药厂)。
1.2 仪器 惠普1050高效液相色谱系列，DAD二级管阵列检测器，色谱工作站。
1.3 色谱条件 色谱柱：YWG-CN 4.6 mm×150 mm，10 μm柱，中国科学院物理化学研究所产品；0.1 M TEAA-乙腈-水(3：9：88，v/v)；流速：1.0 ml/min；检测波长、267 nm柱温：30℃。
1.4 稳定性试验 分别取20 μl C-sis反义寡脱氧核苷酸(AODN)和C-sis硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸(PS-AODN)溶液，加入20 μl胎年血清，充分混匀，于37℃温育，模拟体内进行6稳定性试验，分别于0、15′、30′、45、、1 h、6 h′、1 d、2 d、3 d、4 d、6 d不同时相点，取出样品，加入2 μl内标液，加入80 μl乙腈沉淀，3 000 rpm离心吸取上清液，真空干燥，残留物用40 μl去离子水重溶，取10 μl进样，进行色谱分析。用AODN或PS-AODN的峰高与内标的峰高比，计算两种反义寡脱氧寡核苷酸的体外降解率。
结 果
2.1按色谱条件测定C-sis反义寡脱氧核苷酸、C-sis硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸和内标，血清中成分不干扰C-sis AODN、PS-AODN和内标峰的测定。40-320 μg/ml血浓度范围内线性连良好。血清样品最低检出浓度为20 μg/ml。日内、日间变异系数为1.55-11.5%。样品绝对回收率为96.65±4.29%。样品血浓度测定方法适合作作内、外血浓度测定。
2.2 C-sis反义寡脱氧核苷酸和C-sis硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸在血清中，37℃温育，于0、15′、30′、45′、1 h′、6 h′1 d、2 d、3 d、4 d、6 d不同时相点的降解率分别为0-59.6%和0-89.6%，结果见表。
表 不同时间点的降解情况
时间 AODN PS-AODN
峰高比 降解率% 峰高比 降解率%
0′ 3.65 0 5.05 0
15′ 2.33 36.2
30′ 3.32 36.4
45′ 2.27 37.8
1 h 2.07 43.3 3.85 23.7
6 h 1.89 48.2 3.76 25.5
1 d 1.71 53.1 3.74 25.9
2 d 1.62 55.6 3.40 32.7
3 d 1.24 66.0 2.96 41.4
4 d 0.86 76.4 2.52 50.1
6 d 0.38 89.6 2.04 59.6
(注：PS-AODN样品在15′、30′和45′时间段内无数据)
讨 论
平滑肌细胞迁移和增生是内膜增生的主要特征，C-sis反义寡核苷酸可特异地阻断C-sis原癌基因的表达，从而抑制血管平滑肌细胞增殖。Pickering等发现，人增殖细胞核抗原mRNA的反义寡核苷酸可专一性地减少血管平滑肌细胞(VSMC)中DNA合成及增殖细胞核抗原蛋白含量。硫代修饰的核苷酸，可在36 h后在人VSMC中检测到，并能渗入人动脉硬化斑块中的细胞。因此，可望用反义寡核苷酸用于治疗血管增殖性疾病，尤其是血管成形术后的病人血管的再狭窄。［1，4］ 反义寡脱氧核苷酸用于治疗，在体内必须有一定的稳定性。稳定性好，则体内生物半衰期长，生物效应提高，用量减少，毒副作用减少，费用降低。提高稳定性，主要是增强抗核酸酶为43.3%，第6天降解率为89.6%。我们的研究分说明，硫代磷酸化修饰的C-sis PS-AODN具有较好的稳定性，提示其具有潜在的临床应用前景。 上一页 [1] [2] [3] 下一页
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