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广东汉人HLA |
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rime;-引物和2条3′-引物用来鉴定DR52，一个单一的引物用来鉴定DR53；此外，一对引物用来扩增DRB1基因的第三内含子作为阳性对照。以上引物均由美国Bio-Synthesis公司合成。各引物的碱基组成见Olerup报道。②其它主要试剂：蛋白酶K(Sigma公司)；TaqDNA聚合酶、dNTP(复华生物工程公司)。
1.1.3 主要仪器：PCR扩增仪(美国Coy公司)、电泳仪、紫外检测仪。
1.2 实验方法
1.2.1 DNA抽提(酚／氯仿抽提法)：抗凝血1 ml，经溶解红细胞、消化蛋白质、抽提核酸等步骤，沉淀的DNA溶于三蒸水中备用〔4〕。
1.2.2 PCR扩增：参照Olerup介绍方法进行改良〔5〕。每个标本同时进行19个独立PCR反应。每个PCR反应管中分别含有确定DR相应型别的特异性引物混合物和阳性对照引物。反应体积为30 μl，各组分终浓度为：①Buffer(KCl 50 mmol/L，Tris-HCl 10 mmol/L，MgCl22.0 mmol/L，BSA 0.1 g/L)；②dNTP 200 μmol/L；③组特异性引物每条0.5 μmol/L；④内控制引物0.2 μmol/L；⑤Taq酶1 U；⑥模板DNA约含有100 ng。热循环参数：变性94 ℃ 20秒、退火65 ℃ 50秒、延伸72 ℃ 20秒，共30循环，第一循环前加上94 ℃变性2分钟，最后一循环72 ℃延伸三分钟。
1.2.3 PCR产物检测：PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后EB染色，最后在紫外检测仪下观察结果和记录。
1.3 统计学处理
基因频率计算使用公式：Pi＝1－〔注：Pi为等位基因的基因频率，Fipos为等位基因的阳性频率〕。两组频率比较采用χ2检验。相对危险率RR采用Haldane修正公式〔6〕。
2 结 果
风湿热病人HLA-DR17(相应基因为DRB10301)频率增高(23.3%对6.59%，校正P＜0.05)，其相对危险率RR＝4.67，表明在人群中，该基因携带者患风湿热的机会为不携带者的4.67倍。此外，风湿热病人HLA-DR15、DR12频率降低，但校正P＞0.05，无统计学意义(见第166页表1)。
3 讨 论
HLA-DR检测方法可分为传统方法和基因分型方法。前者以微量淋巴细胞毒试验为代表，该方法取血量大，病人不易接受；且要求即送即检，操作繁琐；最不理想的是，由于抗体多及受人工计数等因素影响，其准确性较差，检出率偏低，从而影响研究结果的可靠性。Opel联合全世界10个实验中心，对世界各地58个器官移植中心的4 000份标本进行回顾性分析，采用基因分型方法发现传统方法的错误率达25%〔7〕。另据Mytilineous对一组1 522例标本进行统计，发现有11%样品用传统方法不能肯定或检不出〔8〕。综上所述，可以认为传统的HLA-DR检测方法存在着明显的缺陷。90年代后，数种HLA-DR基因分型方法相继出现，包括有：①PCR-RFLP；②PCR-SSO或ASO；③PCR-Fingerprint；④PCR-SSCP；⑤PCR-SSP；⑥序列测定技术等。上述方法各有优缺点，本实验采用的PCR-SSP方法很有特点，它不需探针和放射性同位素，在扩增阶段就具有特异性，电泳条件要求不高，花费相对较少，且快速(24小时内)，适于一般实验室采用。
表1 风湿热组与正常对照组HLA-DRB1基因频率分布比较
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